А. Реакции образования амидной связи

Присоединить белок (Ф) к носителю (Н) или сшивающему аген­ту (С) посредством амидной связи можно многими путями и при уча­стии различных функциональных групп. Наиболее часто применяют реакцию ацилирования аминогрупп фермента. В качестве ацилирую-щих агентов используются ангидриды.

О

СООН

С помощью ангидридного метода получено более 20 новых препа­ратов иммобилизованных ферментов, таких, как пенициллинамидаза, пепсин и т. д. Носителями служат в основном сополимеры малеипо-вой кислоты с ненасыщенными соединениями — этиленом, акриловой кислотой — или сополимеры малеинового ангидрида.

Одним из вариантов ангидридного метода является использова­ние полимеров, содержащих ангидридные группы в качестве предше­ственников для получения носителей с разнообразными функциональ­ными группами.

В качестве ацилирующих агентов применяют также активирован­ные эфиры. Например, сополимеризацией 2-оксиэтилметакрилатана с производными метакриловой кислоты получают п-нитрифениловые эфиры полимеров типа «Сферой»:

+ 0

_РН8

10 мин

Эта реакция интересна тем, что в процессе модификации белка высвобождается ион нитрофенила, по которому можно контролиро­вать ход реакции спектрофотометрическим методом.

Б. Реакции образования карбамидных связей (производные мочевины)

Изоцианаты способны эффективно взаимодействовать с различ­ными функциональными группами белков с образованием производ-

ных мочевины — диалкилмочевипы, уретана, уреидов. Наиболее реак­ционными группами белков здесь являются аминогруппы:

рН8

НС — N= С = О + H₂N--- |_Ф

24 ч

О

Изоциаиаты используют для активации неорганических (гидро­окись титана, кремния, алюминия) и целлюлозных носителей. В пер­вом случае реакцию проводят в органическом растворителе, причем часть изоциаиатных групп образует с гидрооксидом карбонат, а остав­шиеся активные группировки могут реагировать в водном растворе с амиио- и гидрооксидными группами белка соответственно в щелоч­ных и слабощелочных средах. Таким образом были иммобилизованы глюкозоамилаза, лактаза и т. д.

Бромциановый метод — один из самых распространенных мето­дов химической иммобилизации ферментов. При обработке бромциа-ном на полисахаридиых носителях формируются реакционноспособ-иые цианатные, имидокарбоиатные группы. При взаимодействии фер­мента с образованным полисахаридом получаются изомочевины и уре-таны.

B₂CN + Полисахарид ► Полиакриламид

Н^

рН 4,7 4°С

NH

5 1RmYxbF0CbdhCUoMi1fRxZ/WWar/F8h+AQAA//8DAFBLAQItABQABgAIAAAAIQC2gziS/gAAAOEB AAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABbQ29udGVudF9UeXBlc10ueG1sUEsBAi0AFAAGAAgAAAAhADj9 If/WAAAAlAEAAAsAAAAAAAAAAAAAAAAALwEAAF9yZWxzLy5yZWxzUEsBAi0AFAAGAAgAAAAhAIZh h40VAgAALAQAAA4AAAAAAAAAAAAAAAAALgIAAGRycy9lMm9Eb2MueG1sUEsBAi0AFAAGAAgAAAAh AFEyJf3bAAAACAEAAA8AAAAAAAAAAAAAAAAAbwQAAGRycy9kb3ducmV2LnhtbFBLBQYAAAAABAAE APMAAAB3BQAAAAA= " o:allowincell="f" strokeweight="1.2pt"> Н —О

NH-

Ф

он

о

Н —о

NH

Ф

ОН

Обработка неорганических носителей (стекло, оксид титана, оксид алюминия) также существенно повышает (в 10 — 15 раз) количество связанного фермента. Кроме того, увеличивается и время функциони­рования иммобилизованного фермента, например глюкозоамидазы.