Применение иммобилизованных биокатализаторов

В медицине

В настоящие время природные физиологически активные веще­ства (ФАВ) белковой природы, в первую очередь ферменты, рассмат­ривают как перспективное средство медикаментозного лечения вслед­ствие их чрезвычайно высокой активности и специфичности. Однако некоторые недостатки ферментов препятствуют их действительно широкому применению в практической медицине. Это мобильность в физиологических условиях, быстрое выведение из организма и разру­шение под действием эндогенных протеаз, антигенность как чужерод­ных организму белков; нередко — токсичность и малая доступность, высокая стоимость. Анализ сложившегося положения привел ученых к выводу, что эти недочеты в большинстве случаев можно устранить, если использовать в практической медицине не нативные ферменты, а их иммобилизованные производные.

Иммобилизация белковых лекарственных препаратов проводится на носителях, которые сами по себе не должны создавать осложнения и способствуют проникновению фермента к желаемой цели. Конечно,

применяемый полимер и сшивающий агент должны быть нетоксичны­ми, кроме того, следует исключить возможность повышения токсично­сти при биодеградации коньюгата. А если фермент иммобилизуется на нерастворимом носителе с острыми углами, он не должен деформи­ровать форменные элементы биологических жидкостей.

Лекарственные вещества белкового или пептидного происхожде­ния, иммобилизованные на соответствующем носителе, представляют собой структуру, модель которой представлена на рис. 31, откуда сле­дует, что возможны значительные ее вариации. Например, если поли­мер растворим, то не требуется солюбилизирующего агента. Если ле­карство заключено в полимерную оболочку (капсулу) и действует на проникающий внутрь капсулы субстрат или катализирует превраще­ние внешнего субстрата при постепенной деградации оболочки, то не требуется химического связывания.

Полимерная цепь

Стабилизация

Биодеградация

Освобождение

лекарства путем

расщепления связи

Специфический вектор

Неспецифический агент

Рис. 31. Модель структуры лекарственного препарата

Желаемые свойства (растворимость, нетоксичность, специфичность) могут быть достигнуты при связывании белка с полимерной целью, которая в свою очередь модифицируется определенным способом. К примеру, известно, что высокомолекулярное соединение само по себе не может проникнуть внутрь клетки путем диффузии, но попадает в нее путем эндоцитоза, если для этого полимер снабжен химическими группами, специфично взаимодействующими с клеточной мембраной.

Вообще нужно стремиться к созданию препаратов, в которых от­мечалось бы высокое содержание лекарства по отношению к количе­ству носителя. Из-за примерной одиопорядковости молекулярной массы на одной молекуле растворимого полимера часто оказывается не бо­лее одной молекулы белка, часть первого сопровождает лекарствен­ный препарат как балласт. Если полимер содержит заряженные груп­пы, можно ожидать хорошего связывания, поскольку образуются ие-ковалентиые комплексы, разделить которые удается только при высо­кой ионной силе раствора. Они могут вести себя как «депо» лекар­ственного средства, находящегося в иативиом состоянии.

Препараты ферментов повышенной молекулярной массы могут быть изготовлены путем немолекуляриого сшивания бифункциональными реагентами. Такие соединения стабильны в физиологических услови­ях, большая молекулярная масса исключает немедленное их выведе­ние почками.

Перспективными направлениями лечения ряда заболеваний явля­ются методы, основанные на гемосорбции и лимфосорбции, которые строятся на пропускании крови через колонку, заполненную соответ­ствующим носителем с иммобилизованным ферментом или без него. Эти носители содержат специфические соединения, способные связы­вать токсины, находящиеся в организме. Иногда удобнее применять твердые их виды, содержащие ферменты. Основное требование к ним — они не должны вызывать деформацию форменных элементов крови. Модификация таких носителей (стекло, керамика, силикаты) с целью введения в них групп, связывающих белки, проводится метода­ми, способствующими вступлению в реакции с ОН-группами носите­лей. Исходный материал для матрицы должен выбираться таким, что­бы наблюдалась минимальная специфическая сорбция.

К медицинским препаратам, иммобилизованным на твердых носи­телях, можно отнести также перевязочные материалы, содержащие обычно протеолитические ферменты, которые применяются для очи­щения гнойных ран.

Лекарственные вещества, в которых соотношение белок / полимер по массе очень высокое и достигает сотен тысяч и выше, могут быть изготовлены с помощью метода «искусственной клетки» и липосом. Они представляют собой микросферы с проницаемой оболочкой.

Первым типом искусственных клеток являются микрокапсулы, представляющие собой крошечные реакторы диаметром от 10³ до 5 х х 10⁴ нм, тонкая оболочка которых (200 — 400 нм) проницаема для низко молекулярных соединений.. Фермент, находящийся внутри обо­лочки, не контактирует с жидкостями и тканями организма, не разру­шается протеииазами, не ингибируется, не вызывает иммунного отве­та. Основное достоинство микрокапсул заключается в том, что их можно имплантировать в нужное место для переработки метаболитов, способствующих росту опухолевой ткани.

Микрокапсулы с белковым содержимым готовятся следующим

образом. Создается микроэмульсия водного раствора вещества в орга­ническом растворителе. Полимерный материал растворен во внешней фазе, к которой добавляют вещества, способствующие его осаждению на капле эмульсии. Растворы содержат также мономеры, полимеризу-ющиеся на границе раздела фаз. Однако следует учесть, что в этом случае существуют диффузионные ограничения. Фермент может быть предварительно стабилизирован перед включением в капсулы. Иног­да последние могут содержать микроскопические участки тканей. Например, есть экспериментальные данные по созданию «депо» инсу­лина путем имплантации микрокапсул, содержащих островки Лангер-ганса, синтезирующие в поджелудочной железе инсулин.

Полимерная стенка обычно изготавливается из прочных полиме­ров. Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут забивать кровеносные сосуды и, следовательно, являться причиной обра­зования тромбов. Однако эффективность при использовании их в виде колонок для диализа в аппарате типа «искусственная почка» несом­ненна. При этом объем аппаратов и количество необходимых и очень дорогих растворов резко сокращается.

Сейчас интенсивно исследуются свойства микрокапсул, стенки ко­торых состоят из оболочек эритроцитов. Без содержимого они назы­ваются «тенью». Стенку заполняют ферментом. Достоинство в этом случае заключается в том, что носитель совместим с организмом па­циента.

Проблему введения лекарственных препаратов в клетки можно решить созданием контейнеров — переносчиков типа липосом и ми­целл. Оболочка может представлять собой однослойную или много­слойную поверхность, образованную в свою очередь бислойной струк­турой, которая создается соединениями, имеющими гидрофильную груп­пу и два достаточно длинных гидрофобных участка. Яркими предста­вителями этих соединений являются фосфолипиды, которые содержат насыщенные углеводородные цепи и плавятся при физиологических температурах. Для каждого их типа имеется определенная темпера­тура плавления твердой структуры.

Липосомы образуются путем обработки ультразвуком водной дис­персии липидов температурой, более высокой, чем нужна для их за­стывания, или впрыскиванием спиртового раствора липида в водную фазу. Лекарство может быть введено внутрь липосомы, если оно гид­рофильно, или в стенку, если оно гидрофобно. Диаметр липосом от 20 до 10³ нм, и поэтому применять их как контейнеры для доставки ферментов нецелесообразно, если нет возможности с точностью наце­лить их на определенную клетку. Однако липосомы имеют и преиму­щества: так как их поверхность легко модифицируется, они могут адсорбироваться на клетке и поглощаться ею путем эндоцитоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сегодня биотехнология стремительно выдвинулась на передовые рубежи научно-технического прогресса благодаря бурному развитию молекулярной генетики и биологии, биохимии и биофизики, опираю­щихся в свою очередь на достижения физики, химии и вычислитель­ной математики, что позволяет использовать потенциал живых орга­низмов в интересах человека. С другой стороны, человечество испы­тывает огромную потребность в новых технологиях, способных лик­видировать нехватку продовольствия, энергетики, минеральных ре­сурсов, улучшить состояние здоровья людей и экологическую ситуа­цию. Решению этих задач может способствовать развитие новых тех­нологий с использованием биообъектов — биотехнологии.

Целью предложенного учебного пособия является ознакомление с основными достижениями биотехнологии на сегодняшнем этапе ее развития, с главными направлениями разработок в области генетиче­ской, клеточной и белковой инженерии, а также прикладными аспекта­ми использования данных методов. Усвоение основных приемов, ис­пользуемых в биотехнологии для выведения новых сортов растений •и пород животных, для создания новых промышленно важных проду­центов биологически активных веществ, а также в медицине, сельском хозяйстве, экологии, производстве дешевой энергии, обезвреживании отходов производств и ряд других, — основная задача представлен­ного курса.