В микроанализе. Биосенсоры

Современные прикладные и фундаментальные науки в своих ис­следованиях нуждаются в высокочувствительных, быстрых и эконом­ных методах анализа. Этого же требуют промышленные процессы, особенно биотехнологического профиля, где необходим точный техно-химический контроль.

Наряду с усовершенствованием различных физико-химических методов в последние годы разрабатываются и находят широкое при­менение те из них, где при анализе используются в качестве реагентов ферменты и другие биологические агенты для обнаружения разнооб­разных веществ.

Известно, что ферменты — это биологические катализаторы, обла-

дающие высокой специфичностью и ярко выраженной способностью избирательно катализировать многие химические превращения как в живой клетке, так и вне организма. Эти свойства ферментов давно привлекали внимание исследователей, в том числе аналитиков, но прак­тическому их применению, например для аналитических целей, пре­пятствовали прежде всего малая доступность чистых ферментов, неустойчивость во времени их растворов, препаратов при хранении и воздействии на них различных факторов (тепловых, химических), не­возможность многократного использования одной порции фермента из-за сложности отделения его от других компонентов раствора, высо­кая стоимость очищенных препаратов. Однако выход из положения вскоре был найден, и появилась возможность применения каталити­ческих свойств ферментов вне их связи с живым организмом и сохра­нения этой способности в течение длительного времени практически без изменения за счет перевода их в иммобилизованное (нераствори­мое) состояние. Достижения в этой области биохимии и энзимологии положили начало развитию нового направления аналитической хи­мии — безреагентных методов анализа, основанных на использова­нии различных биохимических сенсоров.

Биосенсор представляет собой устройство, в котором чувствитель­ный слой, содержащий биологический материал: ферменты, ткани, бак­терии, дрожжи, антигены/антитела, липосомы, органеллы, рецепторы, ДНК, непосредственно реагирующий на присутствие определяемого компонента, генерирует сигнал, функционально связанный с концент­рацией этого компонента. Конструктивно он состоит из двух преоб­разователей, или трансдыосеров, — биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. На рис. 27 приведена общая схема такого устройства.

Биохимический преобразователь, или биотрансдыосер, выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя опре­деляемый компонент, а точнее, информацию о химических связях в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический пре­образователь это свойство фиксирует с помощью специальной аппа­ратуры. В данном случае реализуется принципиально новый способ получения данных о химическом составе раствора. Наличие в устрой­стве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по соста­ву смеси, не прибегая ни к каким дополнительным операциям, связан­ным с использованием других реагентов, с концентрированием и т. д. (отсюда и название — безреагентные методы анализа).

Существует большое разнообразие физических трансдыосеров: электрохимические, спектроскопические, термические, пьезоэлектриче­ские, трансдьюсеры на поверхностных акустических волнах и т. п. На рис. 28 приведен перечень преобразователей, используемых в биосен­сорах. В настоящее время наибольшее распространение получили электрохимические их виды. Одни из них генерируют потенциал на

специальном электроде, на поверхность которого нанесен слой биома­териала, другие генерируют электрический ток реакции продукта пре­вращения определяемого вещества на поверхности электрода, вы­званного биоматериалом. Другими словами, существуют потенцио- и амперометрические биосенсоры. Если физический преобразователь использует изменение светопоглощения в области биослоя, то такой биосенсор называется, например, оптоволоконным, поскольку измеря­емый сигнал будет передаваться измерительному прибору по опти­ческому волокну. Соответствующий физический преобразователь по аналогии с электродом называют оптродом. По названию преобразо­вателя можно сделать вывод о характере физического свойства, кото­рое измеряется аппаратно, причем, как правило, при этом использует­ся микропроцессорная техника (см. рис. 27), позволяющая сделать устройство достаточно компактным.

Схема ферментативной реакции

Е + S*=sES— E + Р Е — фермент, S — субстрат, ES — промежуточный комплекс, Р — продукт (фиксируется физи­ческим преобразователем)

ИШ&*&:

 

Рис. 27. Принципиальная схема биохимического сенсора:

1 — исследуемый раствор; 2 — корпус биосенсора; 3 — полупроницаемая мембрана (для механического удержания биослоя); 4 — слой биоматериала; 5 — физический

преобразователь (электрод, пьезокристалл, оптоволоконный материал и т. д.); 6 — усилитель сигнала; 7 — самописец (дисплей, цифровой или световой указатель)

Первое упоминание об аналитических устройствах на основе фер­ментов или ферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно, в 60-х гг. прошлого столетия. Холинэстеразу, включенную в крахмальный гель и нанесенную на полиуретановую пластинку, ис­пользовали для обнаружения фосфорорганических инсектицидов в воздухе. Этот фермент очень чувствителен к фосфорорганическим со­единениям, легко ими ингибируется. После пропускания анализируе­мого воздуха через ферментный датчик измеряют остаточную актив­ность холинэстеразы. По разнице между исходной ее активностью и

активностью после контакта с воздухом по градуировочному графи­ку находят концентрацию этих токсичных соединений. В настоящее время иммобилизованная холииэстераза используется в автоматиче­ских датчиках в промышленном производстве инсектофунгицидов для постоянного контроля воздушной среды цехов. Затем в обиход вошло понятие «биосенсор», или «биочип». Это важное событие в науке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке, приводящими к появлению новых знаний. Функционально, таким образом, биосенсо­ры сопоставлены с датчиками живого организма — биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические.

Биослой (биологический элемент распознавания)

Целые организмы

Живые ткани

Клетки

Органеллы

Мембраны клеток

Ферменты (индивидуальные)

Препараты ферментов

(неочищенные)

Рецепторы

Антитела

Нуклеиновые кислоты

 

Физический преобразователь

Потенциометрические

Амперометрические

Кондуктометрические

Импедансометрические

Оптические (оптроды)

Акустические

Тепловые

Механические

у Электроды

Рис. 28. Перечень преобразователей, используемых в биосенсорах

Принцип работы биосенсора достаточно прост. Определяемое ве­щество диффундирует через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, в котором и протекает ферментативная реакция по схеме, указанной на рис. 29. Поскольку в данном случае продукт этой реакции определяется с помощью электрода, на поверхности ко­торого закреплен фермент, то такое устройство еще называют фер­ментным электродом. Таким образом, понятия «биосенсор» и «фер-

242

ментный электрод» выступают в данном случае как синонимы. Боль­шинство ферментативных процессов взимосвязаны, т. е. продукт од­ной такой реакции является субстратом другой. Если трудно иденти­фицировать продукт, то берется другой фермент, который превратит его в легко определяемое вещество. С помощью таких сопряженных реакций можно даже увеличить чувствительность анализа.

Схема ферментативной реакции

 

 

П

I тип био­сенсора

На катоде (физический трансдьюсер):

2Н2О

■4ОН"

О₂ + 4е

Ферментативная реакция (биологический трансдьюсер):

 

 

Глюкозоксидаза (

Н2О

S(ox) Глюк кислота)

S(red) + О₂

(Глюкоза)

Н₂О₂

(Глюконовая

 

II тип био­сенсора

На аноде: Н₂О₂— >О₂ + 2Н⁺ + 2е

Рис. 29. Схема работы глюкозного биосенсора:

1 — исследуемый раствор; 2 — корпус биосенсора; 3 — внешняя мембрана;

4 — слой глюкозоксидазы; 5 — внутренняя газопроницаемая мембрана;

6 — платиновый электрод (проволока) для восстановления кислорода;

7 — усилитель сигнала; 8 — самописец (дисплей, цифровой

или световой указатель и т. д.)

По-видимому, самым распространенным в настоящее время явля­ется амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глю­козоксидазы для определения сахара в жидкостях. В качестве физи­ческого трансдьюсера в нем использован так называемый электрод Кларка. В настоящее время для определения глюкозы создано наи­большее число различных биосенсоров, что связано с необходимостью

контроля за содержанием сахара в биологических жидкостях, напри­мер в крови, при диагностировании и лечении некоторых заболева­ний, прежде всего диабета. Схема воздействия биосенсора на глюкозу в принципе типична и для других амперометрических его видов с аналогичным трансдыосером (см. рис. 29). Ток восстановления на платиновом катоде кислорода прямо пропорционален его концентра­ции. В присутствии субстрата (например, глюкозы в крови, взятой для анализа) ферментативная реакция понижает концентрацию О₂. Та­ким образом, ток восстановления кислорода уменьшается пропорцио­нально концентрации субстрата:

Глюкозоксидаза
Глюкоза + О_{2---------------------} ► Глюконовая кислота + Н₂О₂

Преимущество данного типа биосенсора, основанного на кислородном электроде Кларка, состоит прежде всего в его высокой селективности. Эта избирательность определяется особой специфичностью глюкозо-ксидазы и природой электрохимической реакции, в которой участвуют компоненты ферментативного процесса. В целом оксидазы являются высокоспецифичными по отношению к определяемым субстратам. Системы же на основе иебиологического преобразователя, напротив, не столь селективны, как этого бы хотелось, что обусловлено рядом причин. Тем не менее имеются ограничения и по применению данной конструкции биосенсора, обусловленные влиянием кислорода и дру­гих посторонних веществ, способных проникать через биослой (точ­нее, через мембрану), а потому задача совершенствования конструк­ций глюкозных биосенсоров представляется весьма актуальной.

Один из возможных путей такого усовершенствования заключа­ется в следующем. Если изменить полярность включения электрода-трансдыосера в глюкозном биосенсоре на противоположную, т. е. плати­новый катод Кларка сделать анодом, то при потенциале +0,6 В он становится совершенно невосприимчив к кислороду, но зато дает от­клик на пероксид водорода, который при данном значении потенциала окисляется до воды. Эта чувствительность оказалась привлекатель­ной, а поскольку Н₂О₂ образуется как продукт ферментативной реак­ции, по его содержанию можно сделать вывод о концентрации, напри­мер, глюкозы в различных объектах. Другой способ улучшения селек­тивности биосенсоров и устранения помех от посторонних примесей состоит в использовании различных мембран — пленок, предотвраща­ющих попадание этих веществ непосредственно на электрод-преобра­зователь. При этом внутренняя мембрана выполняет функцию защи­ты от примесей, а внешняя пропускает субстрат в биослой. Имеются и другие средства повышения избирательности физических преобразо­вателей, в данном случае электродов. Например, с помощью специаль­ных приемов, называемых химической модификацией, можно до такой степени изменить свойства поверхности электрода, что он будет «глу­хим» к большинству примесей и, напротив, чувствительным к компо­нентам ферментативной реакции.

Биосенсоры, основанные на кислородном электроде как физиче­ском трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: кроме глюкозы еще и лактаты, L -аминокислоты, салици-латы, оксалаты, пируваты, т. е. анионы соответствующих карбоновых кислот. В литературе описаны другие устройства подобного типа, ряд которых применяется на практике.

Для устранения влияния мутности и цвета исследуемых объектов на величину сигнала шведскими учеными был разработан микрокало­риметрический датчик на основе иммобилизованных ферментов (рис. 30).

 

|

самописец

L

термистор |— | самописец

30 мм
а б

Рис. 30. Микрокалориметрический датчик для определения метаболитов: а — схема измерительного блока, где 1 — крепление колонки; 2 — металлический блок; 3 — термистор; 4 — микроколонка, заполненная иммобилизованным фермен­том; 5 — внутренняя часть блока; 6 — водяная баня; 7 — теплообменник; б — общая схема установки, где 1 — измерительная колонка с ферментом; 2 — теплообменник; 3 — колонка сравнения с ферментом; 4 — водяная баня

С помощью биосенсоров можно решить и обратную задачу: при некоторой определенной концентрации субстрата оценить активность собственно фермента по величине измеряемого сигнала (потенциала, тока и т. д.). Последний зависит не только от концентрации субстрата, но и от каталитической активности биологического преобразователя, т. е. фермента. Такое использование биосенсоров позволяет изме-

рить активность большого числа ферментов, например, в крови. Так, оценка активности аспартатаминотрансферазы или креатинкипазы, связанных с сердечной деятельностью, позволяет в клинических усло­виях определить степень инфаркта миокарда. Измерение активности амилазы используется в педиатрии.

Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность, ис­пользование выполненных на их основе биосенсоров не может быть экономически целесообразным. Поэтому применение бактерий, мик­роорганизмов и биологических тканей различного происхождения более предпочтительно, поскольку в данном случае отпадает необходимость в предварительном получении и очистке биокатализаторов. К суще­ственным недостаткам таких биосенсоров можно отнести низкую се­лективность вследствие того, что клетки живых организмов фактиче­ски являются источником самых разнообразных ферментов. Помимо этого время отклика данных устройств на основе тканей и микроорга­низмов может быть достаточно большим, что также уменьшает их практическую ценность. Тем не менее в последние годы наблюдается повышенный интерес к разработке конструкций электродов, содержа­щих не сами ферменты в очищенном виде, а их первозданные источ­ники — биологические материалы. Так, было установлено, что ткане­вые срезы в биосенсорах могут выполнять функцию источников каталитической активности. Например, создан тест на аскорбиновую кислоту, состоящий из упомянутого электрода Кларка и пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы. Активность фермента в такой природной матрице достаточна для про­ведения 50 — 80 определений аскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года в 50%-м глицерине.

Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного сенсора. В качестве примера таких устройств можно на­звать амперометрический сенсор, чувствительный к аммиаку (в сточ­ных водах) на основе иммобилизованных нитрифицирующих бакте­рий и кислородного электрода Кларка. Он полезен при решении во­просов охраны окружающей среды, и, в частности, при контроле степе­ни очистки промышленных стоков.

Можно отметить также использование биосенсоров на основе гид-ролаз — ферментов, являющихся катализаторами гидролитического расщепления субстратов. Эти устройства предназначаются, как пра­вило, для эколого-аналитического контроля остаточных количеств пе­стицидов класса фосфорорганических соединений, а также для опре­деления некоторых отравляющих веществ (ОВ). Действие таких био­сенсоров может быть основано на следующих реакциях. Если при гидролизе какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образу­ется электрохимически активное соединение, то, следя за содержанием последнего, можно контролировать ферментативную реакцию так же,

как в предыдущих случаях. Однако в присутствии ингибиторов актив­ность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу, реги­стрируемому электродом, причем чувствительность такова, что изме­нение определяется уже при действии очень малых количеств этих ве­ществ — на уровне пико- и фемтограмм, т. е. 10"¹² — 10~¹⁵ моль/л.

С учетом разнообразия ферментов, присутствующих и действую­щих в живом организме и являющихся потенциальными биологиче­скими преобразователями, можно отметить, что существующее сегод­ня число конструкций биосенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз. Эти устройства получают распространение в биотех­нологии. Хотя здесь и встречаются трудности, связанные с невысокой их термической устойчивостью, приводящей к дезактивации биослоя, есть основания полагать, что данный недостаток будет в скором време­ни преодолен. Так, полагают, что для увеличения срока службы биосен­соров в обозначенных выше условиях можно использовать ферменты, выделенные из термофильных бактерий и одноклеточных водорос­лей — микроорганизмов, устойчивых к действию высоких темпера­тур. Некоторые из этих устройств работают по принципу «да — нет», что вполне приемлемо, когда решается вопрос о присутствии ультра­малых количеств высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды.

На очереди создание биосенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов, что позволит создать искусственные органы обоняния и вкуса, а также применить указанные разработки для возможно более точной и информативной диагностики ряда заболеваний. Несомненно, что в ближайшем будущем в этой смежной области биологии и химии следует ожидать новых открытий.