Свойства иммобилизованных различными методами аминоацилаз (субстрат — ацил-О.Ь-метионин)

Технологическая схема установки для получения L -аминокислот представлена на рис. 25.

В качестве исходного вещества используют ацилированные D-, L -аминокислоты (ацил-О^-аминокислоты), полученные обычным хими­ческим синтезом. Их подвергают воздействию фермента аминоацила-зы, который гидролизует только один изомер, приводя к образованию незамещенной L -аминокислоты и оставляя нерасщепленной ацил- D -аминокислоту. Отщепление ацильной группы приводит к резкому увеличению растворимости L -аминокислоты, за счет этого аминокис­лоты легко отделить друг от друга, и выделяется чистая L -форма. Остающаяся ацил-D-аминокислота при нагревании рацемизируется, т. е. опять переходит в смесь ацилированных D,L -аминокислот, и процесс ферментации повторяют сначала. В итоге единственным про­дуктом является L-аминокислота. Причем для аминоацилазы не име­ет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь стро­ение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфич­ность.

Препарат иммобилизованной аминоацилазы готовили следующим

образом. 1 000 л ДЭАЭ-сефадекса перемешивали с 1 100 — 1 700 л водного раствора аминоацилазы при 35 °С и рН 7,0 в течение 10 ч. После фильтрации препарат промывали водой. Выход активности по отношению к первоначально растворенному ферменту составлял 55 — 60 %. Колонна с иммобилизованной аминоацилазой сохраняла более 60 % исходной активности после месяца работы. Регенерация катали­затора в колонне производится путем простого добавления свежего раствора фермента, который опять адсорбируется на носителе. Устой­чивость последнего составляет 5 — 8 лет.

кристаллы L-аминокислот

1 —

Рис. 25. Технологическая схема производства L-аминокислот

из рацемической смеси с применением иммобилизованной аминоацилазы:

резервуар с исходной рацемической смесью; 2 — фильтр; 3 — теплообменник;

4 — биореактор с иммобилизованным ферментом; 5 — испаритель;

6 — кристаллизатор; 7 — сепаратор; 8 — рацемизатор

Пенициллинацидаза (пенициллинамидаза, ацилтрансфераза) относится к третьему классу, катализирует гидролиз боковых цепей пенициллинов и их производных, воздействуя на C-N-связь. Фермен­ты, выделенные из разных источников, имеют различные характери­стики субстратов, и это используется для классификации различных типов пенициллинамидаз. Имеются три их типа. Если фермент гид-ролизует специфический пенициллин V, то он обозначается типом I. Его можно встретить в грибах и бактериях. Ферменты типа II специ­фичны к пенициллину G и содержатся только в бактериях. К III типу относят все пенициллинамидазы, катализирующие гидролиз амино-ациллинов и цефалоспоринов.

При ферментативном гидролизе пенициллинов и цефалоспоринов

образуются соответственно б-аминопенициллаповая (6-АПК) и 7-ами-иоцефалоспориновая кислоты, которые затем используют для полу­чения полусинтетических антибиотиков. Различными компаниями производятся разные препараты иммобилизованной пенициллинами-дазы. По итальянской технологии их готовят смешиванием раствора фермента с триацетатом целлюлозы в хлористом метилене. Образую­щуюся эмульсию с ферментом далее подвергают экструзии в нити. Волокна триацетата целлюлозы, содержащие иммобилизованный фер­мент, размещают вдоль термостатируемой колонны. Общий выход со­ставляет 85 %.

В России на ОАО «Биохимик» для производства 6-АПК исполь­зуют пенициллинамидазу, включенную в полиакриламидный гель, мо­дифицированный глутаровым диальдегидом.

Лиазы. Лиазы относятся к четвертому классу, катализируют от­щепление от субстратов той или иной группы (не путем гидролиза) с образованием двойной связи или, наоборот, присоединение групп к двойным связям. Среди них наибольшее промышленное значение имеют ферменты, участвующие в реакциях синтеза аминокислот и других органических кислот.

Аспартаза (аспартатаммиаклиаза) катализирует реакцию син­теза L-аспарагииовой кислоты из фумаровой кислоты и аммиака. Этот фермент особенно активен у факультативных анаэробных бактерий. Содержится также в бактероидах, находящихся в клубеньках бобо­вых растений.

Аспартаза катализирует реакцию присоединения аммиака по двой­ной связи фумаровой кислоты. Этот процесс не требует присутствия других кофакторов, кроме ионов двухвалентного магния. Фермент накапливается в клетках бактерий при росте культур на богатых сре­дах, содержащих мясной бульон, пептон, дрожжевой экстракт или на­бор большого числа аминокислот.

Получение L-аспарагиновой кислоты, растворимой и иммобилизо­ванной внутриклеточной аспартазой, оказалось неэкономичным в свя­зи с низкой стабильностью. Поэтому для этих целей используют це­лые клетки, включенные в полимерные гели, в частности, в Японии их включают в полиакриламидный гель (ПААГ). Время полуинактива­ции препарата при 37 °С составляет 120 дней (для сравнения: для иммобилизованной аспартазы — 30 дней). Для иммобилизации 10 кг влажных клеток суспендируют в 40 л физиологического раствора, добавляют 7,5 кг акриламида, 0,4 кг метиленбисакриламида, 5 л 5%-го диметиламинопропиоиитрила и 5 л 2,5%-го персульфата калия. Смесь оставляют на 10 — 15 мин и образующийся гель формируют в куби­ки размером 2 — 3 мм.

Исходным сырьем для синтеза L-аспарагиновой кислоты служит фумарат аммония. Его раствор в концентрации 1 моль/л, содержа­щий 0,001 моль/л хлористого аммония, пропускают при рН 8,5 и 37 °С через колонку с иммобилизованными клетками со скоростью

потока 0,6 об/ч. Значение рН, полученного на выходе 2 400 л раство­ра, доводят до 2,8 добавлением 60%-го раствора серной кислоты при температуре 90 °С, затем охлаждают до 15 °С и выдерживают 2 ч. Кристаллизирующуюся аспарагиновую кислоту собирают центрифу­гированием и промывают водой.

В России разработаны и испытаны на пилотной установке биока­тализаторы, полученные иммобилизацией клеток Е. coli-85 с аспар-тазной активностью в гель каррагенана и альгината кальция.

Фумараза (фумаратгидратаза) катализирует реакции синтеза из фумаровой кислоты и воды L -яблочной кислоты, которая находит применение в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и фармацевтических препаратах.

И в этой технологии используют клетки, только с фумаразной ак­тивностью, иммобилизованные в ПААГ. Для подавления побочной реакции образования янтарной кислоты, которая с трудом отделяется от непрореагировавшей фумаровой кислоты, эти клетки обрабатыва­ют детергантами, например экстрактом желчных кислот, в концентра­ции 0,2 % при 37 °С, рН 7,5 в течение 20 ч. По сравнению с интактны-ми иммобилизованные клетки существенно стабильнее, и время их полуинактивации составляет около двух месяцев.

В Италии производят иммобилизованную фумаразу, где фермент включен в полые волокна триацетата целлюлозы с сохранением 40%-й активности.

Изомеразы. Изомеразы относятся к пятому классу ферментов, катализируют реакции изомеризации. Из них в промышленности ^<:широкое применение нашла глюкозоизомераза. Существует несколь­ко типов изомераз, но не все они обладают подлинной глюкозоизоме-ризующей активностью. Практическое применение нашел только фер­мент D-ксилозокетоизомераза, КФ 5.3.1.5, применяющийся для про­изводства глюкозофруктозного сиропа (ГФС) и фруктозы. Это свя­зано с тем, что он не требует присутствия NAD⁺в реакционной среде и обладает высокой термостабильностыо. В связи с практическим па-значением его называют глюкозоизомеразой (ГЛИ).

Фруктоза, или фруктовый (плодовый, медовый) сахар, по сравне­нию с обычным пищевым сахаром, в состав которого она также вхо­дит, но в виде химического соединения с менее сладкой глюкозой, об­ладает более приятным вкусом. Она на 70 % слаще сахара, и по­треблять ее можно в меньших количествах. Это очень важно для боль­ных сахарным диабетом, так как усвоение фруктозы не связано с ин­сулином. Сахар (сахарозу) нельзя заменить Ь-глюкозой, поскольку глюкоза менее сладкая. Этот недостаток можно устранить, если по­следнюю частично изомеризовать во фруктозу ГЛИ.

Во многих странах освоена технология получения эффективных иммобилизованных биокатализаторов с глюкозоизомеразной актив­ностью, многие из которых уже внедрены в производство. Наиболее известные препараты получены следующим образом: адсорбцией фер-

ментного экстракта иа ДЕАЕ-целлюлозе или на пористом алюминии, или на ионообменных смолах; включением ферментного препарата в желатиновый гель с последующей сшивкой глутаровым диальдеги-дом или в полые волокна триацетата целлюлозы.

Для выбора типа иммобилизованного биокатализатора, конструк­ции реактора, условий каталитического процесса в реакторе необхо­димо проведение большой предварительной работы. Это хорошо вид­но на примере того, какие параметры исследовали американские уче­ные при внедрении в производство технологии получения кукурузно­го сиропа с высоким содержанием фруктозы с использованием иммо­билизованной ГЛИ.

Биохимические параметры включают: активность препарата; ста­бильность фермента (время жизни и полуинактивации); производи­тельность в используемом диапазоне времени жизни; оптимальную концентрацию субстрата; влияние концентрации субстрата; воздей­ствие концентрации олигосахаридов; влияние растворенного кисло­рода; минимальное и максимальное время контакта с субстратом; обра­зование побочных продуктов реакции; чувствительность к измене­нию рН и температуры; устойчивость при хранении; вымываемость фермента; рост микроорганизмов; характеристики потока на выходе (состав, цвет, запах, рН, содержание белков и т. д.).

К механическим параметрам относятся: размер, форма частиц и распределение по размерам; насыпная масса в сухом и влажном виде; набухание; сжимаемость; когезия; истирание частиц.

Гидромеханические параметры: перепад давления; тип потока (вос­ходящий или нисходящий); уплотнение слоя; осевая дисперсия и ка-налообразование; распределение времени пребывания; расслаивание; отношение длины к диаметру; минимальная скорость начала псевдо­ожижения.

В ходе анализа вышеприведенных параметров был выбран био­катализатор со следующими свойствами: форма катализатора — су­хие гранулы; внешний вид — окрашен в желто-коричневый цвет; объемная плотность в сухом состоянии — 0,64 — 0,72 г/см³; объем­ная плотность во влажном состоянии — 0,2 г/см³; характерный размер пор — 0,2 мкмоль; активность — не менее 0,04 ед./г; произ­водительность — до 907 кг 42%-го обогащенного фруктозой сиропа на 0,45 кг фермента в течение 1 000 ч; объем пустот в слое — 45 %.

Выбранный размер частиц биокатализатора удовлетворял двум взаимоисключающим требованиям: с одной стороны, эти частицы до­статочно малы, чтобы скорость диффузии не лимитировала скорость всего процесса, а с другой стороны, они велики, чтобы свести к мини­муму перепад давления на реакторе колонного типа со слоем иммо­билизованного фермента. Ниже приводятся оптимальные условия, вы­бранные экспериментальным путем: содержание сухого вещества — 40 — 45 %; глюкозы в исходной смеси — 93 — 96 %; требования к исходной смеси — ее необходимая очистка фильтрованием, обработ-

кой активированным углем и ионообменными смолами; рН — 8,2 — 8,5; допустимое падение рН — на 0,2 — 0,4; температура — 60 °С; активатор — 4 • 10~⁴ моль Mg²⁺; время контакта фермента с субстра­том — 0,5 — 4 ч.

Как следует из условий, для того чтобы процесс шел нормально, необходимо высокое содержание глюкозы в поступающей в реактор смеси. Если в ней доля олигосахаридов превышает 10 %, наблюдается снижение активности биокатализатора. Большой диапазон времени (0,5 — 4 ч) контакта последнего с субстратом объясняется постепен­ной его инактивацией. Активность фермента падает, и при постоянной скорости потока реагентов степень превращения субстрата постоянно снижается. Поэтому для обеспечения необходимого качества продук­ции по мере инактивации фермента время его контакта с субстратом увеличивают путем снижения скорости потока. Необходимо иметь в виду, что размеры реакторов колонного типа определяются гидроме­ханическими свойствами биокатализатора. При нисходящем движе­нии реакционной смеси слой иммобилизованного фермента может сжиматься под давлением, в результате этого сопротивление потоку падает. Учитывая известное время контакта биокатализатора с суб­стратом и заданную производительность всей установки, можно опре­делить размеры и количество колонных реакторов. В данном случае целесообразно установить несколько колонн, так чтобы они инактиви-ровались и заменялись последовательно, Это позволит максималь­ным образом использовать биокатализатор ив то же время обеспе­чить постоянно высокую производительность установки в целом. Тех­нологическая схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы, основанного на использовании им­мобилизованной ГЛИ, представлена на рис. 26. В данном случае для эффективной работы фермента необходимо множество операций пред­варительного разделения и обработки промежуточных продуктов между стадиями получения глюкозы из крахмала (осахаривания) и изомеризацией. Для повышения термической устойчивости а-амила-зы, применяемой для гидролиза крахмала при температуре 105 °С, добавляют ионы кальция, которые в свою очередь ингибируют ГЛИ, поэтому перед поступлением глюкозы в реактор изомеризации их удаляют из среды связыванием ионообменными смолами.

В России получен оригинальный иммобилизованный препарат клеток Streptomyces albogrisedus с глюкозоизомеразной активностью. Их иммобилизацию проводили путем включения в матрицу, состоя­щую из двух гелей — гидроокси Со²⁺ и хитозана. Термообработан-ные клетки влажностью 90 % суспендировали в 6 мл 3%-го раствора, приготовленного на основе 18%-го ацетата кобальта.

Смесь гомогенизировали и по каплям добавляли к 5%-му водному раствору аммиака. В качестве субстрата использовали 2 моля раство­ра глюкозы, содержащей 5 • 10~³моль MgSO₄• 7Н₂О. Ионы кобальта выполняли роль стабилизатора. Испытания на пилотной установке в лабораторных условиях дали неплохие результаты.

крахмал, а-амилаза

глюкозофруктозный сироп

Рис. 26. Технологическая схема производства кукурузного сиропа

с высоким содержанием фруктозы:

1 — резервуар для ожижения и осахаривания крахмала; 2 — фильтр; 3 — резер­вуар для очистки активированным углем; 4 — ионообменник (связывание кальция); 5 — концентратор; 6 — резервуар для подготовки смеси; 7 — колонны с иммобили­зованными ферментами; 8 — резервуар для очистки активированным углем; 9 — катионообменник; 10 — анионообменник; 11 — резервуар для упаривания;

12 — резервуар для охлаждения

Оксидоредуктазы. Иммобилизованные ферменты этого класса по отдельности или в комплексе с другими ферментами используют для холодной стерилизации молока. Тепловая обработка оказывает отри­цательное воздействие на его органолептические свойства, особенно при хранении. Так, в молоке, предназначенном для сыроделия, после этого снижается способность казеина к свертыванию под действием сычужного фермента. Поэтому тепловая обработка в некоторых слу­чаях нежелательна и ее лучше заменить холодной стерилизацией. Существует два ее способа.

Первый способ заключается в воздействии на молоко каталазы с введением перекиси водорода. Так, эффект пастеризации продукта, предназначенного для производства сыра, может быть достигнут без нагревания обработкой 0,05%-м раствором перекиси водорода за счет разрушения последней каталазой и выделения атомарного кислорода. Применение иммобилизованной каталазы делает этот способ эконо­мически выгодным. Однако основным препятствием при ее использо­вании для холодной стерилизации является инактивация фермента перекисью водорода. Проблему можно решить заменой ферментов животного происхождения грибными, которые менее чувствительны к перекиси, либо созданием реакторов, оптимальных для данного про­цесса. Уже получены препараты иммобилизованной на аминокремие-земах каталазы гриба Penicillium vitale, которые характеризуются высокими каталитической активностью, рН и термостабилыюстыо при хранении. Период сохранения половины начальной активности ката­лазы, иммобилизованной на силохроме через углеводный компонент фермента, составляет 45 мес.

Второй способ холодной стерилизации заключается в использо­вании лактопероксидазной системы — лактопероксидазы-тиоцигит- та — и непрерывно выделяющейся перекиси водорода. Промежуточ­ный продукт каталитического окисления тиоцианата под действием лактопероксидазы обладает антибактериальными свойствами. Моло­ко содержит все компоненты этой системы, кроме перекиси водорода. Введение последней можно обеспечить проведением соответствующих ферментативных реакций. Перекись водорода получают путем про­пускания сыворотки через колонну с иммобилизованными на пори­стом стекле ферментами Р-галактозидазой и глюкозооксидазой. Этот способ позволяет обеспечить действие бактерицидной фазы в молоке при нейтральных значениях рН, что используется известной шведской фирмой «Альфа-Л аваль».