В. Реакции образования азометиновых связей

На практике широко применяемым методом специфической моди­фикации аминогрупп белков является образование азометиновых свя­зей в реакциях белков с альдегидами:

н

ОНС----- (СН₂)₃—-СНО + H₂N

Ф

 

НС---- N=CH

CH=N

Ф

При использовании глутарового альдегида необходимо учитывать возможность образования побочных продуктов поликонденсации и полимеризации. Азометиновые связи легко разрушаются в кислых средах с регенерацией исходных веществ. Это свойство применяют для удаления с носителя ковалентно иммобилизованного фермента путем простого изменения рН среды. Для устойчивости к кислым средам проводят реакции восстановления азометииовой группировки. За последние годы глутаровый альдегид был использован для иммо­билизации пенициллииамидазы, пепсина и др. Носителями служили целлюлозы и ее производные, кремнеземы и т. д.

Г. Реакции азосочетания

Соли диазолина могут вступать в различные реакции сочетания. В азосочетании могут участвовать различные группы, но чаще NH₂.

В слабощелочной среде основной мишенью в белке является фе-нольный радикал тирозина.

 

Носитель со связью -N^sN с белком связывается очень прочно. Его получают обработкой полимера 2-(амилофенил)-диоксиланом и диазотированием полученной аминогруппы.

Д. Реакции связывания

По сульфгидрильным группам (-S-S-)

Сульфгидрильные группы в белках встречаются довольно редко, так как они быстро окисляются с образованием тиоловых дисульфид-ных мостиков. Вот это свойство и используется для ковалентной им­мобилизации. Если имеется фермент с SH-группой и носитель с ней же, то в присутствии кислорода они образуют прочную дисульфид-ную связь.

СН

-SH + HS

 

 

 

 

	о
ф	и

■S-S

ф

Для увеличения возможности протекания такой иммобилизации существует два пути:

1) повышение числа сульфгидрильных групп в белке; это можно

сделать посредством обработки белка некоторыми восстановителя­ми — меркаптоэтаиолом, цистеином, боргидратом натрия;

2) использование носителей с большим количеством тиолов. Для этого применяют амипопроизводные сефарозы и сефадекса, модифи­цированные гомоцистеинтиолактоиом, сополимеры акриламида с тио-лосодержащими мономерами и т. д.

£. Радикальные реакции

При фотохимическом распаде алкил- и арилазидов образуются очень реакционноспособные короткоживущие радикалы — иитрены:

R N ►R—N + N₂

Часто эти алкил- и арилазиды входят в состав носителей и сшива­ющих агентов (например, аминоэтилсульфаната). А иитрены реагиру­ют с очень многими группами белка. Если смесь носителя или сшива­ющего агента с алкил- и арилазидом и белок облучают УФ-лучами, то образуется очень прочная связь между иитренами и ферментом.

О

R—N₃+H₂—С—О

О О

Ф

 

R—N+H

О—Ф

О О

R—NH — С—О— Ф

О

Однако здесь нужна осторожность, поскольку часто длина волны максимума поглощения в области УФ алкил- и арилазидов может совпадать с длиной волны (250 — 300 нм), при которой разрушаются белки.

Применение иммобилизованных ферментов

В промышленности

Гидролитические ферменты. Гидролазы относятся к третьему клас­су ферментов, общим их свойством является то, что они катализируют реакции гидролиза, т. е. расщепления более сложных соединений на

более простые с присоединением воды. Этот класс подразделяется на 11 подклассов. Многие гидролазы компартментализированы в тех или иных структурных элементах клетки, отделенных от цитоплазмы мем­бранами. Видимо, такая их локализация защищает важные биополи­меры клетки от деструкции. Грамположительные бактерии выделяют в среду много гидролаз. У грамотрицательных хранилищем послед­них служит периплазматическое пространство наружной оболочки, ограниченное двумя мембранами. В клетках эуокариот гидролазы могут локализоваться в особых органоидах — лизосомах, периплазме или выделяться в среду. Большинство используемых в промышленности гидролитических ферментов представляют собой внеклеточные про­дукты жизнедеятельности микроорганизмов. В то же время некото­рые из них обнаружены в цитоплазме, где они участвуют в метаболи­ческих циклах.

Амилазы — ферменты, катализирующие гидролиз крахмала, от­носятся ко второму подклассу гидролаз, имеют шифр 3.2.1. Они ши­роко распространены в природе, синтезируются многими микроорга­низмами, животными и растениями. К ним относятся а- и р-амилазы, глюкоамилаза и др. За последние 20 лет гидролиз крахмала для по­лучения сиропов различного состава приобрел наибольшее значение из всех промышленных процессов, использующих ферменты. Гидро-лизаты классифицируют согласно содержанию в них редуцирующих Сахаров в пересчете на глюкозу и характеризуют декстрозным экви­валентом (ДЭ), причем чистая глюкоза составляет 100 ДЭ. Подобрав комбинацию ферментов и условий, можно получить продукты с точно определенными физическими и химическими свойствами. Ниже при­ведена общая схема процесса (рис. 21).

После измельчения исходного материала крахмал диспергируют или желатинизируют в водном растворе и ожижают с помощью тер­мостабильной бактериальной а-амилазы при температуре от 80 до 110°С. Этот этап может быть заменен кислотным гидролизом, но, как правило, последний менее эффективен. Ожижение занимает от 2 до 4 ч и обычно завершается, когда величина ДЭ составляет 10 — 20. Оно сопровождается осахариванием, процедуру которого можно ва­рьировать в зависимости от желаемого продукта. Добавление пуллу-ланазы, фермента устраняющего ветвление, и р-амилазы к декстринам приводит к получению сиропа с высоким содержанием мальтозы. По­скольку пригодные для этого микробные Р-амилазы остаются дефи­цитными, жидкость обычно готовят с помощью смеси грибной а-ами-лазы и глюкоамилазы. Такой продукт содержит больше глюкозы, но ее соотношение с мальтозой можно контролировать тщательным под­бором пропорций этих двух ферментов и условий реакции.

Важный промышленный процесс — производство глюкозы для изомеризации ее во фруктозу. После ожижения декстрины быстро охлаждают примерно до 60 °С и обрабатывают глюкоамилазой в течение 24 — 90 ч в зависимости от использованного количества

фермента. Осахаренный крахмал должен содержать не менее 94 — 96 % глюкозы, так как остаточные ди- и олигосахариды часто облада­ют неприятным вкусом, а изомераза не действует ни на один из них. После коррекции рН и ионной силы продукт обрабатывают изомера-

зои.

Крахмал

Бактериальная а-амилаза Пуллуланаза

разветвленные и линейные олигосахариды

линейные олигосахариды

 

E 0WtI1umWrSwk3IkNv4tKQ7pRIItc/m9QfAMAAP//AwBQSwECLQAUAAYACAAAACEAtoM4kv4AAADh AQAAEwAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAW0NvbnRlbnRfVHlwZXNdLnhtbFBLAQItABQABgAIAAAAIQA4 /SH/1gAAAJQBAAALAAAAAAAAAAAAAAAAAC8BAABfcmVscy8ucmVsc1BLAQItABQABgAIAAAAIQAb F1rkFQIAACwEAAAOAAAAAAAAAAAAAAAAAC4CAABkcnMvZTJvRG9jLnhtbFBLAQItABQABgAIAAAA IQCtSfkH3AAAAAkBAAAPAAAAAAAAAAAAAAAAAG8EAABkcnMvZG93bnJldi54bWxQSwUGAAAAAAQA BADzAAAAeAUAAAAA " o:allowincell="f" strokeweight="1.2pt">

I

Глюкоамилаза

-Амилаза

мальтоза

глюкоза

Грибная а-амилаза

Глюкозоизомераза

мальтоза и мальтотриоза

сироп с высоким содержанием фруктозы

Рис. 21. Схема гидролиза крахмала

Проблема реализации непрерывной технологии стоит в эффек­тивной иммобилизации второго фермента — глюкоамилазы. Во-пер­вых, потому что а-амилаза считается более доступной и дешевой, и в принципе нет необходимости в ее регенерации. Ею обрабатывают крах­мал при кипячении в течение нескольких минут. Во-вторых, реакция иммобилизованной а-амилазы с малорастворимым, вязким крахмалом проходит с трудом. Кроме того, глюкоамилаза реагирует с раствори­мыми олигосахаридами, что сравнительно легко осуществить и для иммобилизованного фермента.

Сконструированы типы препаратов иммобилизованного фермента, обладающие хорошими свойствами, полученные ковалентным связы­ванием с пористым силикагелем через глутаровый диальдегид, вклю­чением в полые волокна триацетата целлюлозы, адсорбцией на ДЭАЭ-целлюлозе и т. д. Все эти препараты характеризуются высокой ста­бильностью при умеренных температурах (< 50 °С), время полуинак-

тивации составляет многие месяцы. Однако оно сокращается до 5 — б дней, если температура повышается, стабильность препаратов в этом случае резко падает. Схема пилотной установки для получения глю-козного сиропа с применением иммобилизованной глюкоамилазы при­ведена на рис. 22.

 

горячая вода

а-амилаза

I

фильтр

сигнальное устройство

I- У

глюкозный сироп

Рис. 22. Технологическая схема производства глюкозного сиропа

с применением иммобилизованной глюкоамилазы:

1 — резервуар для обработки крахмала паром; 2 — резервуар для обработки а-амилазой; 3 — биореактор с иммобилизованной глюкоамилазои

Исходный крахмал помещается в резервуар объемом 1 м³ (1), где обрабатывается паром в течение 3 — 4 мин под давлением и далее перекачивается в следующий резервуар такой же вместимости (2). Там он подвергается обработке а-амилазой.

После фильтрования разжиженный крахмал подается в реакци­онную колонну — биоректор (3), загруженный 16 кг иммобилизован­ного на микропористом кремнеземе фермента. Гидролиз декстринов проводится при температуре 40 °С. Время контакта 30%-го раствора декстринов с иммобилизованным ферментом составляет 9 мин, в то время как при гидролизе растворимой глюкоамилазои оно составляет при тех же условиях 72 ч.

fi-Галактозидаза (p-D-галактозидгалактогидролаза, лактаза, КФ 3.2.1.23) относится к глюкозидазам. Ферменты из разных источников по своей структуре, размеру молекулы, молекулярной массе и активно­сти различаются, что позволяет получать их виды с широким диапазо­ном действия. В результате гидролиза ферментом молочный сахар (лактоза) превращается в более сладкую и хорошо растворимую смесь моносахаров — глюкозы и галактозы, и поэтому препараты |3-галакто-зидазы широко применяют в молочной промышленности и в тех от­раслях, где можно использовать отходы молокоперерабатывающеи промышленности, содержащие лактозу.

^12^22^11 ⁺Н₂О -> С₆Н₁₂О₆+ С₆Н₁₂О₆

В Италии освоено промышленное производство безлактозного молока с применением иммобилизованной лактазы (рис. 23).

 

;

 

Рис. 23. Технологическая схема получения безлактозного молока

с использованием иммобилизованной лактазы:

1 — резервуар с молоком; 2 — биореактор с иммобилизованным ферментом;

3 — асептический резервуар

Снятое молоко из резервуара (1) пропускают через стерилизатор (температура — 142 °С, время — 3 сек), быстро охлаждают до 4 — 7 °С и прокачивают через реакционную колонну (2) в асептический резервуар емкостью 500 л (3). Биореактор емкостью 20 л содержал 4 кг иммобилизованного фермента, включенного в волокна триацетата целлюлозы. Волокна закрепляли вертикально в нижней и верхней точках реактора. Молоко через него можно пропускать многократно со скоростью 7 л/мин до достижения заданной степени конверсии. Производительность установки —Ют безлактозного молока в день.

В Англии запущен полупромышленный процесс гидролиза лакто­зы в молочной сыворотке с помощью иммобилизованной р-галактози-дазы. Установка находится в действии 5 дней в неделю непрерывно и обрабатывает 30 т сыворотки, производя 1,7 т сахарного сиропа (рис. 24).

 

уксусная кислота

соляная кислота

 

 

 

	i
i Ш
щ
сыворотка

Рис. 24. Технологическая схема установки для гидролиза лактозы

в молочной сыворотке (компания «Милк Маркетинг», Англия):

1 — резервуар для подготовки сыворотки; 2 — контроль рН; 3 — контроль

температуры; 4 — ионообменники; 5 — реакционная колонка с иммобилизованным

ферментом; 6 — резервуар с разбавленной уксусной кислотой

Сыворотку перед введением в биореактор подкисляют в резерву­аре (1), пастеризуют, производят ультрафильтрацию и пропускают через ионообменники (4) для деминерализации. После этого ее проводятчерез реактор (5) с иммобилизованной лактазой нисходящим пото­ком. Используемый здесь фермент ковалентно связан с пористым си-ликагелем с помощью глутарового диальдегида. Биореактор перио­дически очищают разбавленной уксусной кислотой из резервуара (6).

Мощность установки составляет 360 л/ч, а степень гидролиза — 80 %.

Протеолитические ферменты — пептидгидролазы (шифр КФ 3.4), катализирующие гидролиз пептидов и белков. Основной реакцией, осуществляющейся при участии ферментов, является гид­ролиз пептидной связи. Биокатализаторы часто синтезируются в не­активной форме, т. е. в зимогенах, которые или хранятся в клетке, или

проходят от места их синтеза к тому центру, где они необходимы в активной форме. В частности, в клетке в неактивной форме транспор­тируются трипсин, пепсин, химотрипсин, карбоксидазы. Их активация осуществляется по одному из двух путей: а) образование активных ферментов из предшественников автокаталитически; б) образование активных форм в присутствии ионов металлов. Протеазы нашли ши­рокое применение в промышленности и в медицине (табл. 4).

Таблица 4

Применение протеаз

 

№	Фермент	Источник	Область применения
	Трипсин	Поджелудочная железа животных	Медицина, мягчение мяса, осветле­ние пива
	Пепсин	Желудок животных	Медицина, мягчение мяса, свертыва­ние молока
	а-Химотрипсин	Желудок животных	Медицина
	Ренин (химозин)	Желудок теленка	Производство сыра, свертывание молока
	Панкреатическая протеаза	Поджелудочная железа животных	Медицина, производство моющих средств, мягчение и обезволашивание кожи
	Папаин	Папайя	Медицина, осветление пива, мягчение мяса
	Бромелаин	Ананас	Медицина, мягчение мяса, осветление пива
	Фицин	Инжир	Медицина, мягчение мяса, осветление пива
	Протеаза	Aspergillus oryzae	Осветление и вкусовая обработка сакэ
	Протеаза	Aspergillus niger	Производство кормов, медицина
	Протеаза «Субтилизин»	Bacillus subtilis	Производство детергентов, мягчение мяса, производство рыбных гидролизатов
	Протеаза	Streptomyces griseus	Производство детергентов, рыбных гидролизатов и мягчение мяса

Иммобилизованные протеазы можно использовать для свертыва­ния молока. Такой процесс необходимо проводить в два этапа — вы­держки продукта с ферментом и каогуляции. Только в этом случае достигается непрерывность процесса, так как при его одностадийно-сти образуются творожные сгустки вокруг частиц нерастворимого фер­мента, что затрудняет доступ к нему порции молока. На стадии вы-

держки предусматривается обработка последнего иммобилизованным ферментом при температуре ниже 15 °С. При таком режиме происхо­дит гидролиз к-казеина, но молоко не каогулирует. Это осуществля­ется после обработки ферментом в холоде нагреванием и термостати-рованием при температуре 37 °С. Процесс агрегации белков молока происходит после гидролиза 80%-го к-казеина. В России получены препараты химотрипсина, ковалентно связанного с КМ-целлюлозой, и модифицированного, сорбированного на анионитах. Они обладают до­статочно высокой активностью и испытаны на молокосвертывающую способность.

Положительные результаты дали также испытания сычужного фермента, иммобилизованного на поливинилспиртовых волокнах и включенного в гель альгината кальция при производстве сыра. Рео­логические показатели и характер пространственной структуры сгуст­ка были аналогичны при использовании иммобилизованного и сво­бодного сычужного ферментов. Однако для внедрения их в произ­водство необходимо решить проблему стерилизации стабилизирован­ных ферментных препаратов после нескольких циклов работы.

Аминоацилазы относятся к подклассу 3.5 и объединяют фер­менты, действующие на C-N-связи, отличающиеся от пептидных. Спо­собность аминоацилаз различать L- и D -аминокислоты используют в промышленности для производства последних и других, в том числе незаменимых. Получение оптически активных аминокислот разделе­нием их рацемических (оптически неактивных) смесей было одним из первых процессов, осуществленных с помощью иммобилизован­ных ферментов на промышленном уровне. Раньше он проводился с применением растворимого фермента — аминоацилазы, но был недо­статочно эффективным. После перехода на иммобилизованную амино-ацилазу его продуктивность возросла в 1,5 раза, и в настоящее время в Японии осуществляют на промышленном уровне производство боль­шинства незаменимых аминокислот.

Чтобы найти оптимальную форму иммобилизованного фермента для этого процесса, японские ученые провели обширные исследова­ния, результаты которых изложены' в табл. 5.

Эти данные говорят о том, что для промышленного использования помимо начальной активности необходимо учитывать и многие дру­гие факторы. В данном случае исследователи остановились на ами-ноацилазе, иммобилизованной ионными связями на ДЭАЭ-сефадексе, в силу высокой активности, простоты получения, возможности регене­рации и устойчивости такого катализатора, который к тому же без какого-либо механического разрушения и снижения связывающей активности функционирует 5 лет.

Таблица 5