Гемолитические анемии – это различные по этиологии, патогенезу и клиническим проявлениям наследственные и приобретенные заболевания, объединенные одним общим признаком – усиленным разрушением (гемолизом) эритроцитов. В норме продолжительность жизни эритроцитов составляет 90-120 дней. При гемолитических анемиях она может сокращаться до 12-14 дней.
В физиологических условиях около 90% состарившихся эритроцитов разрушаются в макрофагах селезенки (внутриклеточный гемолиз) с образованием желчных пигментов. 10% эритроцитов разрушается в капиллярах сосудистого русла (внеклеточный, или внутрисосудистый гемолиз) с выделением свободного гемоглобина, который связывается с белком плазмы гаптоглобином. При гемолитических анемиях может усиливаться как внутриклеточный, так и внеклеточный гемолиз эритроцитов.
К гемолитическим анемиям, обусловленным усиленным внутриклеточным гемолизом эритроцитов, относятся в основном наследственные заболевания, имеющие хроническое течение. Для них характерно нарушение мембран эритроцитов, приводящее к повышению их проницаемости для ионов натрия и воды, в результате чего эритроциты приобретают сферическую форму. Сфероциты не могут проходить через синусы селезенки, задерживаются в них и разрушаются. Усиленный гемолиз эритроцитов в селезенке приводит к увеличению её размеров вплоть до спленомегалии [от греч. splēn селезенка + megas, megalos огромный]. Повышенный внутриклеточный гемолиз эритроцитов сопровождается образованием увеличенного количества желчных пигментов. Для гемолитических анемий с внутриклеточным гемолизом характерны клинические проявления в виде анемии, желтухи и спленомегалии, а также лабораторные признаки внутриклеточного гемолиза: гипербилирубинемия за счет свободного билирубина, увеличение стеркобилина в кале (кал темно-коричневой окраски), уробилинурия (моча цвета крепкого чая), снижение осмотической резистентности эритроцитов.
Гемолитические анемии с внутрисосудистым гемолизом относятся к приобретенным заболеваниям и развиваются остро под влиянием неблагоприятных факторов (антител, токсинов). При разрушении эритроцитов внутри сосудов в кровь выходит большое количество свободного гемоглобина, который выделяется с мочой, окрашивая её в бурый, темно-коричневый цвет. Лабораторным признаком внутрисосудистого гемолиза эритроцитов является гемоглобинурия.
4.5.2. Классификация гемолитических анемий
1. Наследственные гемолитические анемии:
- эритроцитопатии: обусловлены нарушением мембраны эритроцитов (наследственный микросфероцитоз, овалоцитоз, стоматоцитоз, акантоцитоз);
- энзимопатии: обусловлены нарушением активности ферментов эритроцитов;
- гемоглобинопатии: обусловлены нарушением структуры цепей глобина
(серповидноклеточная анемия) или нарушением синтеза цепей глобина (талассемия).
2. Приобретенные гемолитические анемии:
- иммунные: обусловлены воздействием антител (гемолитическая болезнь новорожденных, переливание несовместимой крови, болезнь холодовых агглютининов и др.);
- пароксизмальная ночная гемоглобинурия;
- связанные с механическим повреждением мембран эритроцитов («маршевая» гемоглобинурия, протезы клапанов сердца);
- связанные с воздействием паразитов (малярия);
- связанные с воздействием гемолитических ядов (мышьяк, яды змей, грибов и др.).
Лабораторная диагностика. Для большинства гемолитических анемий характерно циклическое течение болезни. В период обострения (гемолитический криз) гемолиз эритроцитов резко усиливается, количество эритроцитов и гемоглобина падает. Вне криза (период ремиссии) их количество снижено в меньшей степени. Цветовой показатель крови при большинстве гемолитических анемий в пределах нормы, при талассемии – понижен до 0,3-0,4. Изменения морфологии эритроцитов проявляются в виде анизоцитоза и пойкилоцитоза: при наследственном микросфероцитозе эритроциты имеют форму микросфероцитов; при серповидноклеточной анемии – эритроциты в виде серпа; при талассемии – мишеневидные эритроциты и т.д. В период гемолитического криза наблюдается ретикулоцитоз. Осмотическая резистентность эритроцитов при большинстве гемолитических анемий снижается.
4.5.3. Гемолитическая болезнь новорожденных
Гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН) – заболевание, обусловленное иммунологическим конфликтом из-за несовместимости крови плода и матери по антигенам эритроцитов. Характеризуется усиленным гемолизом эритроцитов и токсическим воздействием продуктов гемолиза на организм плода и новорожденного.
Гемолитическая болезнь новорожденных чаще развивается в результате резус-конфликта. При беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом резус-антиген плода через плаценту проникает в организм матери и на него начинают вырабатываться антитела. Антитела анти-резус не причиняют вреда организму матери, но часть их переходит через плаценту в кровь плода, вызывая агглютинацию и разрушение эритроцитов.
Усиленный гемолиз эритроцитов приводит к увеличению содержания в крови токсичного продукта распада гемоглобина – свободного билирубина. В норме он обезвреживается в печени, ферменты которой переводят токсичный свободный билирубин в нетоксичный связанный билирубин путем присоединения двух молекул глюкуроновой кислоты. Однако печень новорожденного ребенка еще незрелая, и активность ферментов в ней невысока, поэтому большое количество свободного билирубина полностью не обезвреживается, и он накапливается в крови – развивается гипербилирубинемия. При рождении ребенок может выглядеть здоровым, но в течение первых суток жизни у него развивается желтуха. В более тяжелых случаях желтушность отмечается уже при рождении. Печень и селезенка увеличены. В крови билирубинемия, низкий уровень гемоглобина и эритроцитов, содержание ретикулоцитов увеличено. Общее состояние новорожденного зависит от степени билирубиновой интоксикации и поражения ЦНС. При повышении уровня свободного билирубина до критической концентрации 320-340мкмоль/л он начинает проникать через гематоэнцефалический барьер и поражает клетки головного мозга - развивается так называемая «ядерная» желтуха.
Лечение гемолитической болезни новорожденных направлено на быстрейшее связывание и удаление из организма токсичного непрямого билирубина. Для этого новорожденному с высоким содержанием билирубина, угрожающим развитием ядерной желтухи, проводят заменное переливание крови.
Физиологическая желтуха новорожденных проявляется в первую неделю жизни ребенка и обусловлена билирубинемией, развивающейся вследствие большой нагрузки на ферментные системы печени. Для новорожденных первых дней жизни характерна чрезвычайно высокая концентрация стероидных гормонов (особенно эстрогенов), которые, как и билирубин, инактивируются в печени путем присоединения глюкуроновой кислоты. Первые 3-5 суток жизни вся глюкуроновая кислота идет на обезвреживание эстрогенов, так как они имеют с ней большее сродство, чем билирубин. При этом в крови накапливается свободный билирубин и развивается желтуха. Максимального развития физиологическая желтуха достигает к 4-5 суткам и исчезает к 11-14 суткам.
4.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМАТОКРИТНОЙ ВЕЛИЧИНЫ
Гематокритотражает соотношение объема плазмы и форменных элементов крови. За гематокритную величину принято считать объем эритроцитов.
Для определения гематокрита используются методы:
- унифицированный с помощью микроцентрифуги;
- унифицированный микрометод (Тодорова);
- с помощью гематологических анализаторов.
Унифицированный метод определения гематокритной величины с помощью микроцентрифуги
Принцип. Центрифугирование крови в присутствии антикоагулянтов в течение определенного времени при постоянном числе оборотов центрифуги.
Специальное оборудование: микроцентрифуга для определения гематокрита в комплекте со специальными капиллярами.
Реактивы: один из антикоагулянтов: раствор гепарина 1000 ЕД/мл или 4% раствор трилона Б (ЭДТА).
Ход определения. В предварительно обработанный антикоагулянтом и высушенный капилляр набирают кровь из пальца на 7/8 длины капилляра. Укупоривают капилляры с одного конца специальной пастой (или пластилином) и помещают их в ротор центрифуги так, чтобы укупоренные концы упирались в резиновую прокладку. Центрифугируют 5 минут при 8000 об/мин. По специальной шкале, приложенной к центрифуге, определяют гематокритную величину.
Нормальные величины гематокрита. У мужчин гематокритная величина составляет 40-48%; женщин – 36-42%.
Клиническое значение. Снижение гематокритной величины характерно для анемии. Этот показатель широко используется в практической медицине для оценки степени анемии: чем ниже гематокрит, тем тяжелее анемия. Повышение гематокритной величины наблюдается при эритроцитозах.
4.7. ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ
Наряду со зрелыми эритроцитами в крови циркулирует небольшое количество ретикулоцитов. Это молодые, незрелые эритроциты, имеющие в цитоплазме нежную сеточку или зернышки, которые называются зернисто-нитчатой субстанцией. Чем моложе ретикулоцит, тем эта субстанция обильнее.
В зависимости от густоты и расположения зернисто-нитчатой субстанции различают 5 групп ретикулоцитов.
1. Венчикообразные ретикулоциты. Это клетки с ядром, вокруг которого в виде короны или веночка располагается базофильная ретикулоцитарная сеточка. Ядро лежит эксцентрично, у края клетки, готовясь покинуть её путем выталкивания.
2. Глыбко - или клубкообразные ретикулоциты. Безъядерные клетки. Ретикулярная сеточка имеет вид глыбки или плотно намотанного клубка, расположенного в центре клетки или эксцентрично.
3. Полносетчатые ретикулоциты. Ретикулоцитарная сеточка как бы разматывается из клубка и полностью покрывает всю поверхность клетки.
4. Неполносетчатые ретикулоциты. Видны отдельные нити базофильной ретикулоцитарной сеточки.
5. Пылевидные ретикулоциты. Базофильная субстанция имеет вид единичных зерен, преимущественно по периферии клетки.
У здоровых людей в периферической крови преобладают ретикулоциты 4-5 групп (до 80%).
При обычных методах окраски мазка ретикулоциты не выявляются, так как зернисто-нитчатая субстанция воспринимает красители только тогда, когда жива клетка. При высыхании мазков, а тем более при их фиксации ретикулоциты погибают и зернисто-нитчатая субстанция не окрашивается. Для ее окраски используется особый метод, называемый суправитальным (прижизненным). При этом ретикулоциты окрашивают сразу после их выхода из кровяного русла, не допуская высыхания клеток. Для окраски используют один из красителей: азур I, азур II, бриллианткрезиловый синий, под действием которых зернисто-нитчатая субстанция приобретает синий цвет.
Унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов
Принцип. Суправитальная (прижизненная) окраска красителями, выявляющими зернисто-нитчатую субстанцию.
Реактивы. Можно использовать один из следующих реактивов:
1) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте;
2) раствор азура I - 1%;
3) раствор азура II - 2%.
Окраска ретикулоцитовможет проводиться как на предметном стекле, так и в пробирке.
Окраска на стекле. Хорошо вымытые и обезжиренные стекла слегка подогревают над спиртовкой. Стеклянной палочкой наносят 1 каплю одного из красителей, делают мазок из краски шлифованным стеклом и высушивают его. В таком виде мазки можно готовить впрок и хранить в закрытой посуде в темном месте. На мазок краски наносят 1 каплю крови и готовят из нее тонкий мазок. Тотчас же, не давая высохнуть крови, помещают мазок во влажную камеру (чашку Петри с уложенной по бортикам фильтровальной бумагой) на 3-4 минуты. Высушивают на воздухе и микроскопируют.
Окраска в пробирке. Метод 1. В пробирку помещают: 4 капли краски 1 и 1 каплю 1% оксалата калия; вносят туда 2 капилляра Сали (0,04мл) крови; закрывают влажной ваткой, перемешивают и оставляют на 30 минут; снова перемешивают и готовят тонкие мазки.
Метод 2. В пробирку помещают 0,05 мл краски 3 и 0,2 мл крови; смесь закрывают влажной ваткой, тщательно перемешивают и оставляют на 20-30 минут; перемешивают и готовят тонкие мазки.
Метод 3. В пробирку помещают 0,3-0,5 мл краски 2 и 5-6 капель крови капилляром Панченкова; закрывают пробирку резиновой пробкой, тщательно перемешивают и оставляют на 1-1,5 часа; перемешивают и готовят тонкие мазки.
Подсчет количества ретикулоцитов. Окрашенный одним из описанных методов мазок микроскопируют с иммерсионной системой: окуляр 7 Х, объектив 90 Х, конденсор поднят. В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция – в синий цвет. Подсчитывают не менее 1000 эритроцитов, отмечая среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Ретикулоциты как молодые эритроциты входят в счет 1000 эритроцитов. Для облегчения подсчета используют ограничитель поля зрения, готовя его таким образом, чтобы одновременно в поле зрения находилось около 50 эритроцитов. Затем просчитывают 20 таких полей зрения.
Количество ретикулоцитов может быть выражено тремя способами: их числом на 1000 эритроцитов, в процентах или в промилле. 1 промилле (‰) = 1/1000.
Нормальное количество ретикулоцитов: 2-12 на 1000 эритроцитов, или 0,2-1,2%, или 2-12 ‰.
Клиническое значение количества ретикулоцитов. Изменение количества ретикулоцитов наблюдается в основном при анемиях и характеризует активность костного мозга. Уменьшение их содержания свидетельствует об угнетении функции костного мозга, что характерно для гипо- апластических и В12-дефицитных анемий, лучевой болезни. Увеличение количества ретикулоцитов указывает на активацию работы костного мозга и встречается при гемолитических анемиях.
4.8.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
Под резистентностью (стойкостью) клеток понимают их способность противостоять разрушительным воздействиям: осмотическим, механическим, тепловым, химическим и др. В клинической практике наибольшее распространение получило определение осмотической резистентности эритроцитов.
В растворе с осмотическим давлением, равным осмотическому давлению крови, эритроциты не изменяются. Солевой раствор, имеющий осмотическое давление, одинаковое с осмотическим давлением крови, называется изотоническим. Изотоническим солевым раствором для эритроцитов является 0,85% раствор хлорида натрия. В гипертонических солевых растворах эритроциты сморщиваются, а в гипотонических – набухают и разрушаются (гемолизируются).
Осмотическую резистентность эритроцитов исследуют по отношению к гипотоническим растворам хлорида натрия разной концентрации. Концентрацию хлорида натрия, при которой начинают гемолизироваться первые, наиболее слабые эритроциты, принимают за начало гемолиза, а концентрацию, при которой разрушаются все эритроциты – за полный гемолиз.