ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ ОТИТОМ

Земко В.Ю. (5 курс, лечебный факультет) Гончарова А.И. (аспирант)

Научный руководитель: к.м.н., доцент Окулич В.К.

УО «Витебский государственный медицинский университет»,

г. Витебск

Актуальность. Бактерицидная активность сыворотки крови - свойство свежей сыворотки крови вызывать гибель проникших или внесенных в нее бактерий. Обусловливается раздельным или совокупным действием антител, комплемента, лизоцима и других менее идентифицированных факторов. Изучение соотносительного значения перечисленных факторов показало, что инактивация комплемента существенным образом снижает бактерицидную активность крови, добавление антител резко повышает ее, отсутствие лизоцима приводит к более или менее выраженному снижению активности сыворотки в зависимости от чувствительности к ним бактерий. Механизм кооперативного действия представляется так: система антитело-комплемент разрушает клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану, в свою очередь, лизоцим - пептидогликан клеточной стенки. Уровень бактерицидной активности является интегральным показателем антимикробных свойств сыворотки крови. Падение его указывает на глубокие нарушения в иммунитете и служит неблагоприятным прогностическим признаком, повышение уровня бактерицидной активности сыворотки оценивается положительно [1].

Изучение изменения активности энзимовпомогает в изучении патогенеза различных заболеваний. В связи с этим определение активности ферментов при сопоставлении с изменениями других показателей и клинической картиной заболевания в целом имеет диагностическую значимость.

Для определения активности лизоцимав сыворотке крови в качестве субстрата использовали пептидогликан. Выбор субстрата обусловлен тем, что распад пептидогликана происходит в результате расщепления гликозидной связи между N-ацетил-мурамовой кислоты и олигопептидом (тетрапептидом), включающим несколько уникальных аминокислот, в т.ч. D-изомер аланина. Пептидогликан разрушается не только под действием лизоцима, но и в результате активации системы комплемента по альтернативному пути, поэтому для определения активности лизоцима проводили инактивацию комплемента.

Цель. Изучить уровень активности лизоцима в сывороткекровипациентов с острым отитом.

Материалы и методы исследования. Для проведения исследования было отобрано 12 сывороток пациентов с острым отитом и 12 сывороток доноров, находившихся на лечении в Витебской областной клинической больнице. В качестве контрольной группы были взяты лица призывного возраста, находившиеся на плановом обследовании в кардиологическом отделении Витебской областной клинической больницы.

Выделение пептидогликана (ПГ) из клеточной стенки грамположительных бактерий проводили по методике, предложенной Львовом В.Л., Пинегиным Б.В., Хаитовым Р.М. в нашей модификации.

Для выделения пептидогликана из грамроложительных бактерий использовали Micrococcuslysodeikticus ATCC 4698. Для постановки метода использовали пептидогликан, меченый 2%-ым Конго красным (ПМК), сыворотку больного и буферный раствор (0,2 М солянокислый трис-буфер) рН 7,4.

В один ряд эппендорфов вносили последовательно: 40 мкл раствора ПМК, 260 мкл буферного раствора и 100 мкл сыворотки крови. Во второй ряд эппендорфов - 40 мкл раствора ПМК, 260 мкл буферного раствора и 100 мкл сыворотки крови, которую предварительно нагревали в течение часа при температуре 56°С для инактивации комплемента. Контролем служили пробы, содержащие трис-НСl буфер с рН 7,4 в количестве 300 мкл и 100 мкл сыворотки крови. Далее проводили инкубацию проб в термостате при t=37⁰C в течение 24 ч. После инкубации пробы извлекали из термостата и центрифугировали в течение 10 мин (10 тыс. об./мин.; MICRO 120) для осаждения оставшегося неразрушенного ПМК. Из надосадка брали в дублях по 150 мкл раствора и переносили в лунки 96-луночного полистиролового планшета. Планшет помещали в многоканальный спектрофотометр Ф300, где при длине волны 492 нм определяли оптическую плотность в лунках.

Промежуточный результат выражался в оптических единицах и рассчитывался как разница оптических плотностей опытных проб и соответствующих им контрольных. Полученный результат пересчитывали в пикокаталы по формуле:

Y= [-0,001+0,026×Eоп] × 9,921

Где Y – искомый результат;

Еоп – оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля [2].

Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ MicrosoftExcel 2007 и StatGraphicsPlus. Выборки не подчинялись нормальному распределению, анализ проводили методами непараметрической статистики. Рассчитывались медиана (М) и интерквартильный размах (25 % - 75 %). Различия считали статистически значимыми при p< 0,05.

Результаты исследования. В результате исследования было выявлено, что у пациентов с острым отитом активность лизоцима достоверно выше в сравнении с донорами. Также было установлено, что после инактивации комплемента способность разрушать ПГ достоверно снижается у группы доноров, в то время как в группе пациентов с острым отитом различия статистически не значимы. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Уровень активности лизоцима до и после инактивации комплемента у доноров и у пациентов с острым отитом

Выводы. При изучении активности сыворотки крови разрушать пептидогликан, выделенный из Micrococcuslysodeikticus ATCC 4698, достоверно установлен ее повышенный уровень у пациентов с острым отитом в сравнении с донорской группой.

Установлено статистически значимое снижение способности сыворотки разрушать пептидогликан после инактивации комплемента (на 12,8%, р<0,05). Это указывает на то, что активность сыворотки обусловлена актививацией комплемента по альтернативному пути. В то же время, часть активности принадлежит лизоциму, так как разница между группами доноров и пациентов с острым отитом после инактивации комплемента сохраняется.

На основании полученных данных предлагается использовать пептидогликан, меченый Конго красным, в клинико-диагностических лабораториях после доработки (необходимо проверить со стандартным методом) и клинической апробации методики для определения активности лизоцима.

Литература:

1.Goldman A.S., Prabhakar B.S. The Complement System / A.S. Goldman, Prabhakar B.S. // Baron’s Medical Microbiology. — Univ of Texas Medical Branch, 1996.

2.Ziamko V. Method of isolation of peptidoglycan as a basis for measuring murein-destroying activity of blood serum/ V.Ziamko, V. Okulich// Journal of Microbiology and experimentation//Oklahoma, 2014-1 (4)- P.1-2