Классические стратегии отображения промотора белка с использованием обычных репортеров, в том числе chloram-phenicol ацетилтрансферазы (CAT), βгалактозидаза, зеленый флуоресцентный белок или светлячок / рениллы люцифераза, в настоящее время используется для сопоставления регуляторных последовательностей в нескольких промоторах в Plasmodium и Toxoplasma (рассмотрено ниже и в Хорроксе и соавт., 1998; де Конинг-Уорд и др., 2000; мейсснеровский и Soldati, 2005). Регулирующий цис-элементы, которые ВЛЯ-ENCE базальный, а также регулируемая транскрипция в Plasmodium лежит рядом или на ограниченное расстоянии вверх по течению от начала транскрипции (Крабба и скотопромышленника, 1996; Dechering и др, 1999;. Портер, 2001; ост и др., 2002), хотя промотор цис-элементы, были также обнаружены в пределах интронов (Калдервуд и др., 2003) генов вар и в кодирующей области непосредственно после начала перевода в pgs28 (Chow и Wirth, 2003). В Toxoplasma делеции исследования в
определить промотор цис-элементы были зарегистрированы для различных генов ГРЫ, DHFR-TS, тахизоит конкретные SAG1 и енолазами 2, а также для ряда генов, в том числе брадизоитного hsp30 / BAG1, hsp70, LDH2 и енолазами 1. Вместе эти результаты подтверждают что промоторные элементы в основном расположены выше по потоку от поступательного сайта инициации (Soldati и Бутройда, 1995; Мерсье и др, 1996;. Bohne и др, 1997;. Русы и др, 1997;. Nakaar и др., 1998; М и др., 2004; Matrajt и др., 2004;. Kibe и др, 2005). Промоторные элементы наблюдались быть активны или в цепи ДНК, но могут иметь ограниченное рабочее расстояние от начала транскрипции или терять свое влияние, если они находятся вниз по течению от кодирующей области (Soldati и Бутройда, 1995). Уровень детализации в этих исследованиях варьирует, и минимальные элементы последовательности были определены лишь в нескольких исследованиях (ниже и в Mercier и др, 1996;.. Matrajt и др, 2004); более-более, не опубликованное исследование полностью не решен вопрос о функциональной достаточности для любого предполагаемого цис-элемента. Тем не менее, очевидно, что 27-п.о. последовательности повтора (6X повтор) в промоторе SAG1 требуется для функции и элемента последовательности (A / TGAGACG) найдены в промоторов ГРА было продемонстрировано, что требуется для основной экспрессии в контексте 53 п.н. минимальный промотор (Мерсье и др., 1996). Интересно, что GAGACG присутствует в центральной сердцевине SAG1 27 п.н. повторов, и этот элемент также найден в регионах, замешанных содержат регуляторные цис-элементы, путем делеции анализа промоторов NTPI / II и DHFR-TS (Nakaar и др аль, 1998;.. Matrajt и др, 2004). GAGACG мотив или тесно связана последовательность возникла из применения алгоритмов модели обученных на Toxoplasma последовательности целого генома фланкирующими известной и предсказал белки (Mullapudi и Киссинджера, не опубликовано), предполагая, что GAGACG может быть токсоплазмы эквивалент РНК-полимеразы II базальные элементов (ТАТА или САЯТ коробка) высших эукариотических промоторов, которые отсутствуют Apicomplexa промоторов. Этот интригующий вопрос должен быть протестирован experimen-подсчет, так как этот элемент не является универсальным Pres-лора в последовательности генома фланкирующим предсказано или известны первые экзоны или даже другие НКГ-связанные области промотора. Кроме того, наличие предполагая, что GAGACG может быть токсоплазмы эквивалент РНК-полимеразы II базальных элементов (TATA или СААТ коробки) высших эукариотических промоторов, которые отсутствуют Apicomplexa промоторов. Этот интригующий вопрос должен быть протестирован experimen-подсчет, так как этот элемент не является универсальным Pres-лора в последовательности генома фланкирующим предсказано или известны первые экзоны или даже другие НКГ-связанные области промотора. Кроме того, наличие предполагая, что GAGACG может быть токсоплазмы эквивалент РНК-полимеразы II базальных элементов (TATA или СААТ коробки) высших эукариотических промоторов, которые отсутствуют Apicomplexa промоторов. Этот интригующий вопрос должен быть протестирован experimen-подсчет, так как этот элемент не является универсальным Pres-лора в последовательности генома фланкирующим предсказано или известны первые экзоны или даже другие НКГ-связанные области промотора. Кроме того, наличие
| Транскрипционные CONTROL IN Toxoplasma |
этот элемент не является достаточным, чтобы полностью восстановить активность до минимального промотора DHFR-TS (Matrajt и др., 2004).
Как отмечалось в разделе выше, развитие специфических изменений уровней мРНК являются доминирующей чертой транскриптома Apicomplexa. наблюдались почти одна четверть из транскриптов, обнаруженных в недавнем проекте токсоплазмы SAGE быть однозначно выражены в ходе развития паразита-ния; аналогичные наблюдения появились из функциональной геномики исследований внутри- эритроцитарные цикла Plasmodium (Le Roch и др., 2004; Bozdech и Гинзбург, 2005). Развивающее экспрессия гетерологичного белка репортера в Toxoplasma паразитов была впервые достигнута с использованием плазмидных конструкции, содержащие промоторные последовательности из гена hsp30 / BAG1. Эти исследования, используемые щелочной стресс, чтобы стимулировать экспрессию CAT репортера (Bohne и др., 1997),
A АЯ-палиндромная последовательность была отмечена лежать в пределах этой области, хотя ее значение не тестировалось. Промоторы, контролирующие брадизоитные специфические гены, Hsp70 и LDH2, теперь были нанесены на карту с помощью индукции щелочно-стресса при разрешении Сего-Лар BAG1 (Yang и Parmley, 1997; Мы и др., 2004); в то время как эти исследования подтверждают роль промотора элементов в регуляции стресс-реакцию в токсоплазмы, их разрешение является слишком низкой, чтобы обеспечить для идентификации общих цис-элементов. Взаимное регулирование enolases 1 (брадизоитный-специфических) и 2 (тахизоит-специфических) представляет особый интерес, учитывая их близкое расположение в геноме (в упорядоченном массиве тандем енолазы-2-энолазы-1). Репрессия енолаз-1 экспрессия в tachzyoites, как представляется, требует дистальной области> 600 пара оснований из энолазы-1 ATG, и эти элементы отличны от индуктивных элементов, которые были нанесены на карту ближе к началу транскрипции (Kibe и др., 2005). Аналогичным образом, две областей в промоторе енолаза-2 могут играть определенную роль в репрессии этого гена под брадизоитными ули-ции, хотя этот анализ трудно интерпретировать
потому что подавление енолазы-2 конструкций не было полностью достигнуто в этих экспериментах. Как и в других исследованиях, отсутствие функциональной проверки предполагаемых енолазов-1 элементы по внутренней выброске-ции или мутагенез ограничивает возможность нарисовать согласованное мнение критических последовательностей, которые регут-поздние брадизоитную-специфическую транскрипцию.
Используя двойную модель люциферазы, описанный выше, недавно мы сопоставляются брадизоитный специфические цис-элементы в недавно идентифицированный ген Toxoplasma, кодирующих новый NTPase (Brady-NTPase; хромосома X, 42.m03416). Серия последовательных и внутренних делеции с последующей 6-п.н. замещением мутагенеза была выявлен 15 п.н. цис-элемент, который отвечает за индукцию промотора Брейди-NTPase под различными наркотиками и стрессовые условия, которые взаимодействуют индуцировать экспрессию нативного гена брадизоитной, Этот элемент лежит в пределах первых 500 пар оснований промотора Брейди-NTPase, и 90 процентов индукции теряется, когда элемент мутируют в контексте фрагмента промотора полной длины (п.о. тысячи четыреста девяносто-пять). Мутация этого элемента не приводит к увеличению экспрессии в стадии тахизоит, инди-дой, что он является истинным индуктивным элементом. Точное отображение элемента Brady-NTPase в настоящее время ведется для того, чтобы определить точные границы нуклеотидных. По инспекции регионов, участвующих в брадизоитный индукции LDH2 и SAG4.2 промоутеров, мы обнаружили, перекрывается с элементом Брейди NTPase, и в то время как эти сравнения интригующим, проверка отношений между этими промоутерами должны ждать дальнейшего функционального анализа.