Из-за гидрофобную природу rhoptry белков, альтернатива анализа протеома 2-DE была использована для разделения белков, с использованием обычного одномерным SDS-PAGE с последующим иссечением 51 смежных срезов геля, каждый из которых были подвергнут в -gel трипсина-переваривание, а затем тандем МС (МС / МС), чтобы получить данные о фрагментации пептида, подходящих для протеомики данных базового поиска (схематическое изображение полного подхода показано на рисунке 20.3). Как и следовало ожидать, известные rhoptry белки были легко идентифицированы, в том числе членов семьи ROP2 / 4/8 и ROP9. Кроме того, 38 ранее неизвестных кандидатов новые rhoptry белки были обнаружены во фракции. Сочетание подходов был использован для определения истинной локализации новых белков, в том числе идентифицированный эпитоп
мечение и производство антител против пептидов и рекомбинантных белков. Из 13 случайно выбранных белков, которые были проверены, 12 действительно были найдены, чтобы быть локализована в rhoptries. Эти результаты указывают на то, что большой процент из оставшихся белков также будет rhoptry-локализованы и проверки Очистка и анализ схемы. В таблице 20.1 приведены все подтвержденные rhoptry белки, определенные протеомного анализа (полный список всех белков в анализе могут быть найдены в Брэдли и др., 2005).
Одним из наиболее интересных выводов в отношении белков в rhoptry протеоме была подгруппой белков, которые локализуются исключительно в воздуховодах, как rhoptry шеи. Для того, чтобы отличать их от белков rhoptry тела, называемых ROPs, rhoptry шеи белки были названы РОНС (Брэдли и др., 2005). Как было отмечено ранее, четыре РОН (RON1-4) белки были подтверждены продукции антител и локализованы ИФА с шеек органеллы. Чтобы исключить возможность того, что эти белки были окрашивание отделения, кроме rhoptry шеи, локализация была подтверждена для одного из них, RON4, с помощью иммуноэлектронной микроскопии (рис 20.4). После освобождения rhoptry во время вторжения, rhoptry белок шеи RON4 локализован на подвижный узел - структура, которая образует интерфейс между поверхностью паразита и плазматической мембраной хозяина-клетками. RON4 является частью комплекса rhoptry шеи белков, которые включает в себя Ron2, и белок идентифицирован в rhoptry протеомом как TgTwinscan_4705, который в последнее время было показано, чтобы локализовать на rhoptry шеи и назван RON5 (Брэдли и др, 2005;. Лебрен и др., 2005; Wastling и Брэдли, 2007). Все три белка, как полагают, присутствует в движущемся соединении, хотя локализация только непосредственно было показано для RON4 (Alexander и др., 2005). Протеомный анализ, таким образом, помогает раскрыть впервые присутствие и участие rhoptry шеи белков при переходе образование распределительную и явно указывает на сохранение этой структуры на молекулярном уровне между Apicomplexa. который в последнее время было показано, локализуются в rhoptry шеи и назван RON5 (Bradley и др, 2005;.. Лебрен и др, 2005; Wastling и Брэдли, 2007). Все три белка, как полагают, присутствует в движущемся соединении, хотя локализация только непосредственно было показано для RON4 (Alexander и др., 2005). Протеомный анализ, таким образом, помогает раскрыть впервые присутствие и участие rhoptry шеи белков при переходе образование распределительную и явно указывает на сохранение этой структуры на молекулярном уровне между Apicomplexa. который в последнее время было показано, локализуются в rhoptry шеи и назван RON5 (Bradley и др, 2005;.. Лебрен и др, 2005; Wastling и Брэдли, 2007). Все три белка, как полагают, присутствует в движущемся соединении, хотя локализация только непосредственно было показано для RON4 (Alexander и др., 2005). Протеомный анализ, таким образом, помогает раскрыть впервые присутствие и участие rhoptry шеи белков при переходе образование распределительную и явно указывает на сохранение этой структуры на молекулярном уровне между Apicomplexa.
Неожиданно было обнаружено, протеомики анализ также идентифицирует-Fied известных белков Toxoplasma Rab11 и toxofilin как присутствующие в rhoptry фракции
| ПРОТЕОМИКА АНАЛИЗ RHOPTRY органелл Т. гондий | |||
| (А) органелл изоляция | (В) отделение белка | (С) ESI-МС / МС срезов геля | |
18 -21 22 23 24 25 26
28, б, в
29, б, в
30a, б
rhoptry белки (D) Предполагаемые 
ROP1
| ROP 11 | сливаться | |
| (G) Иммунолокализация | (F), производство антител (Е) Рекомбинантная экспрессия |
РИСУНОК 20,3 Схема для протеомики анализа rhoptry органелл Т. гондий.
(A) Rhoptry органелла была приготовлена из тахизоитов лизированных в изотонической сахарозе, чтобы сохранить нетронутые органеллы и органеллы фракционированной Percoll и градиентами сахарозы (только один градиент показана здесь для простоты).
(B) Очищенные органеллы были затем разделены одномерным SDS-PAGE и 51 отдельных полос вырезали из геля и перевариваются.
(C) Полосы были подвергнуты LC с последующим ESI-MS / MS. Данные МС были найдены в базе данных, содержащей 881 411 белковых последовательностей, загруженных из ToxoDB для идентификации белков в геле каждого среза.
(D) были идентифицированы 38 новые белки rhoptry.
(E) Поднабор из них были выбраны и выражали в виде His6-тегов слитых белков и очищали с помощью никелевого-агарозы хроматографии.
(F) Очищенные белки вводили мышам для получения поликлональных антител.
(G) Со-локализация этих новых rhoptry белков была проверена с помощью иммунофлуоресценции (Брэдли и др., 2005).
Эта цифра воспроизводится в цвете в разделе Цвет пластины.
(Bradley и другие., 2005).Thesefindingswere Удивительно, потому что этот белок был ранее
подтверждается Иммунолокализация использованием antibod- был локализован в основном на паразита апикальной цито-
х годов, индуцированные против очищенных рекомбинантных белков протоплазмы и показано взаимодействие с актином паразита
и, в случае toxofilin, паразиты инженерии и белок фосфатазы 2C (Poupel и др., 2000;
чтобы выразить С-концевой HA-меченый вариант из Делорм и др., 2003). Возможный биологический signif-
белка. Поиск toxofilin в rhoptries было icance этих результатов обсуждаются в другом месте
554 ПРОТЕОМИКА OF токсоплазма
Таблица 20,1 Rhoptry (РОП) и rhoptry шеи(RON) белки Токсоплазм обнаружена протеомным анализ и подтверждены иммунолокализациями
| Имя MW (кД) | число Пи | функция | |
| ROP1 | 5,8 | пенетрация | |
| повышение коэффициента? | |||
| ROP2 * | 7,8 | PVM-Host | |
| митохондрии | |||
| ассоциация | |||
| ROP4 * | 8,5 | неизвестный | |
| ROP5 * | 9,8 | неизвестный | |
| ROP8 * | 9,2 | неизвестный | |
| ROP9 | 7,1 | неизвестный | |
| ROP10 | 4,2 | неизвестный | |
| ROP11 * | 7,7 | неизвестный | |
| ROP12 | 4.5 | неизвестный | |
| ROP13 | 9,4 | неизвестный | |
| ROP14 | 9,0 | неизвестный | |
| ROP15 | 8,6 | неизвестный | |
| ROP16 | 9,0 | Предполагаемые киназы | |
| RON1 | 4,9 | неизвестный | |
| Ron2 | 9,7 | Двигаясь узел | |
| сложный | |||
| RON3 | 9,3 | неизвестный | |
| RON4 | 6,3 | Двигаясь узел | |
| сложный | |||
| Toxofilin | 9,6 | Актин / PP2C связывание? | |
| Rab11 | 10,6 | мембранном | |
| из GTPase | |||
Рассчитывается молекулярная масса (ММ), изоэлектрическая точка (ИЭТ) и предполагаемая функция (если они известны) из rhoptry и rhoptry шеи белков обнаружены протеомного анализа и подтверждены иммунолокализации (Брэдли и др., 2005). МВт и ИТ рассчитываются из первичного продукта транслы включая сигнальный пептид, если он присутствует; *çíàê ðàâíî ROP2 белки семейства.
(Брэдли и др, 2005;. Wastling и Брэдли, 2007); однако, несколько удивительно характер этих наблюдений подчеркивает преимущество протеомики исследования, которое не предполагает ничего ожидаемого результата и не зависит от наличия специфических реагентов, которые могут ограничить ширину экспериментального исследования.
Брэдли и др JBC 2006, том 80, с разрешения
РИСУНОК 20,4 Иммунолокализация RON 4 к rhoptry шеек токсоплазма. Иммуноэлектронная микроскопия с применением анти-RON4 антителами показывает, что RON4 локализован в горловинной часть (стрелка) из rhoptries (R) и нет в луковичных органах органеллы. Линии также указывают на коноида (С) и micronemes (M). RON4 представляется наиболее заметным на стыке части тела и шеи органеллы, и присутствует в образцах от обоих тахизоитов и bradyzoites.
Весь Т. Gondii rhoptry белки изученных на сегодняшний день по всей видимости, синтезируются в виде про-белки, которые затем обрабатываются в их зрелых формы. Для того, чтобы под самоприготовлением роли про-область в функции rhoptry белка, МС-анализ был использован для определения сайта обработки про-область белка rhoptry ROP1 (Брэдли и Бутройд, 1999). Попытки определить такие участки обработки ранее предотвращено блокированного N-концах зрелых белков, выделенных из T.gondii,, таким образом предотвращая анализ с помощью обычного N-концевой аминокислотной последовательности. Чтобы преодолеть эту проблему,
| ДРУГИЕ СУБ-Протеом ИССЛЕДОВАНИЯ Т. гондий |
сконструированная форма ROP1 была разработана и МС используется, чтобы продемонстрировать, что про-ROP1 обрабатывается для его зрелой формы между глутаминовой кислотой в положении 83 и аланине в положении 84.