Белки, которые не разрешимы на 2-DE, конечно, не поддается анализ ПГЛПА, и не-геля на основе методов должны быть рассмотрены для относительного белка количественного. Устойчивые методы изотопного мечения были разработаны, которые показывают consid-жалкого потенциал для МСА на основе количественного анализа белков. Один из таких способов включает в себя использование Изотоп-кодированный Сродство Пометка (МЦПК) реагентов (Смолка и др., 2001). Это влечет за собой цистеин-REAC-TIVE фрагмента, биотин аффинной метку для выделения меченных белков, и область линкера, состоящую из восьми водородов (светло-тегов) или восемь (deuteriums тяжелых тегов). Каждый протеом затем помечены с легкой или тяжелой реагентом ICAT, и образцы смешивают и анализируют одновременно с помощью ЖХ-МС / МС. Для количественной оценки, относительные сигналы одинаковых пептидов, меченных либо тяжелой или легкой метка анализируемой в режиме MS затем могут быть использованы для измерения относительного количества одного белка против другого. Тем не менее, МЦПК имеет ряд ограничений, первичную один из которых является требование свободного цистеина на белке быть помечены. Считается, что целых 20 процентов любого данного протеомом отсутствует свободный цистеиновый остаток, следовательно, устраняя их из анализа. МЦПК, однако, были успешно использованы с микроорганизмами, таких как микобактерий туберкулеза для сравнения вирулентных и ослабленных формы бактерии (Schmidt и др., 2004), а также trypomastigote и амастигота этапы Trypanosoma Тгурапозота (ПАБК и др., 2004). Будущие достижения в области не-гель на основе количественного анализа, вероятно, лежат в разработке технологий для изотопной метки в естественных белков. При таком подходе, стабильные изотопы включаются в метаболические продукты и относительные различия между этими продуктами от паразитов, выращенных в нормальных и меченого изотопом сред сравниваются.
Паразит образец 1
метили Cy3
| МОЖЕТ ПРОТЕОМИКА быть количественной? |
Объединенный внутренний стандарт
представляющие все образцы в
исследование метили Cy2 Паразит образец 2 метили Cy5
Смешайте меченые экстракты
Отдельный от 2-DE
изображение Cy3 изображение Cy2 изображение Cy5
| Наложение изображения | Идентификация Пятно & |
| количественное определение |
Рисунок 20.2 DIGE анализ токсоплазма. В типичном эксперименте, два паразит образцов помечены каждый с различным CyDye (Су3, Cy5, соответственно), а также внутренним стандартом, состоящим из смеси образцов, меченных Cy2. Три меченые образцы затем смешивают вместе и разделены на 2-DE. Гель сканировали при трех различных возбуждения и излучения длин волн, уникальных для каждого CyDye. Специализированное программное обеспечение соответствует CyDye-меченых проб на каждом геле, а также соответствует пятна через наборы геля для того, чтобы обнаруживать дифференциально экспрессированных белков. ПГЛП Fluor минимальные красители имеют NHS-эфирной группы, которые могут образовывать ковалентную связь с эпсилон-аминогруппы остатков лизина в белках с помощью амидной связи. Все три CyDyes являются размером и заряд соответствует обеспечению равной миграции на геле 2-DE. CyDyes очень чувствительна и способны обнаруживать около 125 мкг одного белка с линейным откликом на концентрацию белка до пяти порядков. Эта цифра воспроизводится в цвете в разделе Цвет пластины.
550 ПРОТЕОМИКА OF токсоплазма
Хотя еще не разработано для Toxoplasma, в естественном условиях эксплуатации изотопного мечение поглощения паразита тяжелых изотопов, содержащий изолейцин было успешно использовано в качестве количественной протеомики подхода к Plasmodium (Nirmalan и др., 2004).