Как обсуждалось ранее, наличие сложной базы данных генома для T.gondii, имеет важное значение для поддержки анализа данных токсоплазмы MS, так как экспериментальные данные MS должны быть сопоставлены с подходящей базы данных белков. В настоящее время данные MS могут быть найдены против ТМФ-ческих белковых последовательностей, содержащихся в самой последней версии ToxoDB (www.toxodb.org), дата-база Toxoplasma геномного, кДНК-последовательности, а также модели белка предсказания составлены из последовательностей, представляющих собой Всего ~ 10×размер генома Toxoplasma и, таким образом, вероятно, содержат практически весь геном. Например, Брэдли и его сотрудники искали токсоплазмы rhoptry белка данных MS против локально построенной базы данных в общей сложности 881 411 последовательностей вниз нагруженной из ToxoDB, в том числе 790 796 геномных открытых рамок считывания больше, чем 50 аминокислот, ЭЧТ из ~ 69 000 кДНК-клоны, 4954 Мерцающих НММЫбелок предсказание, 8336 TigrScan белок предсказание, и 7588 Twinscan белка предсказания для Toxoplasma (Bradley и др., 2005). Для каждого идентифицированного белка, точное положение каждого пептида проверяется на выравнивания генома с ЭЮ и модели прогнозирования белка с использованием общего модели генов организма данных базовыми строительный набора (GBrowse, www.gmod.org/), доступными для T.gondii, в www.toxodb.org.
ToxoDB также поддерживает прямой поиск данных MS / MS в различных общих выходов, таких как те, из MASCOT (https://www.matrix-science.com/), с помощью Глобальной Протеом Machine (GPM) (HTTP: / /www.toxodb.org/tandem/) сделал
+20,5 МОЖЕТ БЫТЬ ПРОТЕОМИКУ
Количественный?
Гель-анализ на основе
В общем со всеми протеомами, Toxoplasma протеомы являются весьма динамичными и отражать биологическое состояние паразитов во время отбора проб. Сравнение протеомов на различных стадиях жизни и в разных условиях, таким образом, имеет потенциал для выявления кое-что о характере биологического ответа на специфические стимулы. Например, мы можем пожелать, чтобы понять, что происходит с протеомом когда тахизоиты транса-форма в bradyzoites, или то, что происходит, когда мы выбиваем ген, кодирующий белок в определенном биохимическом пути. Такие сравнения полезны для понимания не только основной биологии паразита, но и как химиотерапевтические соединения могут действовать на паразита, на основе лекарственной устойчивости, а также принимающей ответ на Infec-ние. Для этих типов анализов,
Важно, чтобы сделать различие между абсолютной и относительной количественному количественному в протеомики. Абсолютные Количественная в протеомики является чрезвычайно сложной областью, которая очень по-прежнему находится в зачаточном состоянии. В то время как некоторые успехи, достигнутые в абсолютном количественному (.. Godovac-Циммерман и др, 2005; Ishihama и др, 2005), исследования наиболее «количественная протеомика» относятся к относительным количественному белков - то есть, determin-ную степень, которой белок или группа белков вверх или подавляются в различных условиях.
548 ПРОТЕОМИКА OF токсоплазма
Ранние способы гель на основе и не-гель на основе протеомики были подвергнуты критике за то, что, как известно, не количественный характер. Например, разделение белков с помощью 2-DE может привести к недопустимому изменению гель-к-гель, если не выполняется квалифицированно. Обычный анализ геля, таким образом, требовалось несколько гелей, которые будут работать, чтобы устранить экспериментальные изменения. Последние достижения, однако, преобразовали количественный характер 2-DE сравнений. Во-первых, наличие чувствительных флуоресцентных белковых пятен с высоким динамическим диапазоном, например, Sypro Ruby (Steinberg и соавт., 1996), были устранены проблемы нелинейности и плохой динамический диапазон окрашиванием серебром. Во-вторых, прогресс в технологии гель на основе, такие, как введение иммобилизованных градиента рН полоски для первой размерности разделения, наличие предварительно литых пластиковых спинками гелей второго измерения,
Последние разработки в области сравнительной технологии 2-DE является разница гель электрофорез, широко известный как Dige. ПГЛП эффективно элим-гель вариации при изо-к-гель, и обходит проблемы, присущие с гелем-к-гель сравнений. Предпосылка Dige является то, что два образца интер-ЭСТа помечены различными флуоресцентными красителями, смешивают вместе и работать на одной и той же 2-DE гель. Третий образец, внутренний стандарт, позволяет точно сопоставления и выявления незначительных различий в экспрессии белка с статистической достоверности гель-к-гель. Специализированное программное обеспечение затем используется для обнаружения, количественной оценки, позиционного соответствия, и дифференциальное экспрессии белка Analy-лиза. Статистический анализ основан на (1) дифференциале в геле-анализе (А), включая белка точечной DETEC-ции и количественный на пару изображений из того же геля; и (2) Биологический анализ вариации (BVA), предполагающее согласование нескольких изображений из различных гелей, чтобы представить статистические данные о дифференциальных уровнях экспрессии между несколькими группами. Общая схема, показывающая Dige анализ Toxoplasma белков показана на рисунке 20.2.
С помощью мощного программного обеспечения визуализации, ПГЛП позволяет чувствительной и воспроизводимое отображение сотен потенциальных изменений белка между двумя образцами, которые затем могут быть выбраны с помощью робота-SPOT-резак и идентифицированных с помощью масс-спектрометрии.