Модуляция протеомом хост-клеток Т. гондий

Чтобы понять, каким образом протеом Т. гондий взаимодействует с клетками-хозяевами, необходимо знать кое-что о том, как хозяин реагирует на паразита во время и после вторжения в клетки. Изменения в гене и экспрессии белка могут ожидаться во внутриклеточной инвазии и создании, однако для определения точного характера этих модуляций важно в понимать-кий, как и почему Toxoplasma такого повсеместно и успешно внутриклеточный патоген. Blader и сотрудники исследовали в пробирке изменений экспрессии генов хозяина-клеток во время нашествия Т. гондий, с использованием микрочипов, состоящие из приблизительно 22 000 известных генов и охарактеризованных выраженные метки последовательности (Blader и др., 2001). На ранних этапах инфекции (1-2 ч),<1 процента всех генов показали значительные изменения в обилии их Tran-скриптов, со значительным усилением активности провоспалительных генов, а также генов, участвующих в перераспределении органелл и защиты от апоптоза. Корреляция между стационарными транскрипционных данных и синтеза белка у эукариот не известно. Кроме того, для многих белков их функциональная активность зависит не от обилия их мРНКа, а на посттрансляционных модификациях, такие как phosphoryla-ции, которые не являются послушным путем транскрипционного анализа. Следовательно, в последнее время мы пытались моделировать изменения в растворимой хост-клетки протеома во время и после вторжения в пробирке клеток Т. гондий использования протеомики. В этом эксперименте,

После ПГЛПА анализа паразита-инфицированных клеток, дифференциально экспрессированные белки были идентифицированы с помощью функций MS анализа и белков, предназначенных для каждого, используя функцию белка Ассигнационного инструменты, такие как программы Биоинформационного Harvester (www.harvester.embl.de) и те, у человеческого белка База данных ресурсов (www.hprd.org), для того, чтобы изменения модели Тропинка после вторжения пара-сайта. Все белок, модулированных в исследовании, были назначены функциональной классификация, основанной на схеме, выдвинутой Информационный центр Мюнхена для последовательностей белков (HTTP: // mips.gsf.de/projects/funcat). Схема для обработки биоинформатики ПГЛПА данных от паразитов-инфицированных клеток показана на рисунке 20.5. Классы белка, которые были модулированных включены те, которые связаны с апоптозом, митоза, гликолиза, метаболизма липидов, синтеза нуклеозидов, и цитоскелета. Изменения в клетке-хозяине протеомом согласовывались с задержанием как апоптоза и клеточного деления. Кроме того, гликолиз повышалась, как это было синтез белков цитоскелета, предположительно из-за клетке-хозяине ремоделирования. Немаловажное следует отметить большое количество хозяина митохондриальных белков, которые были изменены в выражении во время инфекции, на долю которых приходится почти одна треть всех модулированных белков.

Дизайн эксперимента над протеомикой был намеренно предназначен, чтобы отразить, что в более ранних исследованиях транскрипционных Blader и сотрудниками, с тем чтобы обеспечить возможность изучить корреляцию между транскрипционными изменениями и принимающим протеомом в процессе Inva-Sion. Так как только дифференциально экспрессированные белки были выбраны для анализа MS, только сравнение этого подмножества белков было возможно. Тем не менее, достаточные данные были помогли-в состоянии показать, что около 60 процентов дифференцированно выраженных транскрипционных данных согласуются с данными протеома (хотя, возможно, более важно, 40 процентов не согласны). Что интересно,

вторжение. В сочетании с данными Blader и сослуживцев, которые также рассмотрены транскрипционные изменения во время вторжения с другой trypanoso-matid паразита, Т. Тгурапозота, эти данные свидетельствуют о том, что очень сильно реакция на Toxoplasma вторжения весьма специфичен, и более сложным, чем простое реакция на стресс. Эти исследования дают огромное количество информации, на которой можно строить более детальные функциональные исследования на подрывную клетку-хозяина этого паразита.

ХИМИЧЕСКИЕ ПРОТЕОМИКА

Одним из недостатков методов протеомики, как они стоят в том, что они в основном предоставляют информацию только о личности и обилие белков. Хотя много информации потенциально получить-состоянии с помощью анализа MS, таких как природа и степень PTMs, на практике эффективных методов быстрой идентификации PTMs (например, phosphoryla-ции) в значительной степени недостаточно развиты и еще не были реализованы для токсоплазмы. Характер-зации белка-белка или ингибитора белка-взаимодействий также в основном забывают классическими методами протеомики. В ответ на этом поле химической протеомики недавно было создано в качестве средства для профиля глобальных моделей активности фермента за счетом использования синтетических малых молекул, известных как активность на основе зондов (ABPS) (Cravatt и Соренсен, 2000; Гринбаум и др., 2000, 2002а). В сочетании с классической биохимией и генетическими исследованиями, эти химические реактивы, предназначены для отчетливого подмножества ферментативных целей, чтобы помочь идентификациям и активности на основе профилирования (ABPP). Зонды Активности на основе может быть использованы для профилирования активности нескольких белковых мишеней в одном эксперименте без необходимости генерировать количество реагентов рекомбинантных ферментов. Например, общий цистеина протеазы зонд, DCG-04, был использован в профиль цистеина активности протеазы в малярийного плазмодия (Гринбаума и др., 2002b). Совсем недавно, первый высокой пропускной экран для небольших молекул, способных нарушить биологические процессы в T.gondii, была выполнена (Кэри и др., 2004). С помощью анализа микроскопии на основе, более 12 000 структурно разнообразной мала эти химические реактивы, предназначены для отчетливого подмножества ферментативных целей, чтобы помочь идентификациям и активности на основе профилирования (ABPP). Зонды Активности на основе может быть использованы для профилирования активности нескольких белковых мишеней в одном эксперименте без необходимости генерировать количество реагентов рекомбинантных ферментов. Например, общий цистеина протеазы зонд, DCG-04, был использован в профиль цистеина активности протеазы в малярийного плазмодия (Гринбаума и др., 2002b). Совсем недавно, первый высокой пропускной экран для небольших молекул, способных нарушить биологические процессы в T.gondii, была выполнена (Кэри и др., 2004). С помощью анализа микроскопии на основе, более 12 000 структурно разнообразной мала эти химические реактивы, предназначены для отчетливого подмножества ферментативных целей, чтобы помочь идентификациям и активности на основе профилирования (ABPP). Зонды Активности на основе может быть использованы для профилирования активности нескольких белковых мишеней в одном эксперименте без необходимости генерировать количество реагентов рекомбинантных ферментов. Например, общий цистеина протеазы зонд, DCG-04, был использован в профиль цистеина активности протеазы в малярийного плазмодия (Гринбаума и др., 2002b). Совсем недавно, первый высокой пропускной экран для небольших молекул, способных нарушить биологические процессы в T.gondii, была выполнена (Кэри и др., 2004). С помощью анализа микроскопии на основе, более 12 000 структурно разнообразной мала Зонды Активности на основе может быть использованы для профилирования активности нескольких белковых мишеней в одном эксперименте без необходимости генерировать количество реагентов рекомбинантных ферментов. Например, общий цистеина протеазы зонд, DCG-04, был использован в профиль цистеина активности протеазы в малярийного плазмодия (Гринбаума и др., 2002b). Совсем недавно, первый высокой пропускной экран для небольших молекул, способных нарушить биологические процессы в T.gondii, была выполнена (Кэри и др., 2004). С помощью анализа микроскопии на основе, более 12 000 структурно разнообразной мала Зонды Активности на основе может быть использованы для профилирования активности нескольких белковых мишеней в одном эксперименте без необходимости генерировать количество реагентов рекомбинантных ферментов. Например, общий цистеина протеазы зонд, DCG-04, был использован в профиль цистеина активности протеазы в малярийного плазмодия (Гринбаума и др., 2002b). Совсем недавно, первый высокой пропускной экран для небольших молекул, способных нарушить биологические процессы в T.gondii, была выполнена (Кэри и др., 2004). С помощью анализа микроскопии на основе, более 12 000 структурно разнообразной мала был использован в профиль цистеина активности протеазы в малярийного плазмодия (Гринбаума и др., 2002b). Совсем недавно, первый высокой пропускной экран для небольших молекул, способных нарушить биологические процессы в T.gondii, была выполнена (Кэри и др., 2004). С помощью анализа микроскопии на основе, более 12 000 структурно разнообразной мала был использован в профиль цистеина активности протеазы в малярийного плазмодия (Гринбаума и др., 2002b). Совсем недавно, первый высокой пропускной экран для небольших молекул, способных нарушить биологические процессы в T.gondii, была выполнена (Кэри и др., 2004). С помощью анализа микроскопии на основе, более 12 000 структурно разнообразной мала

560 ПРОТЕОМИКА OF токсоплазма

(А) обнаружение пятна и статистический анализ

повышалась белки

подавляются белки

(D) Функциональное перераспределение

(B), масс-спектрометрии и идентификации белков (С) Функциональная категоризация

РИСУНОК 20.5 Анализ биоинформатики дифференциальной экспрессии хост-клеточных белков после инфекции с Т. гондий.

(A) Белки, которые дифференцированно выражены между инфицированных и неинфицированных клеток легко обнаруживается специализированным программным обеспечением ПГЛП включая среднее изменение объема между образцами и статистической Analy-лиза. Статистический анализ основан на дифференциальных In-гель анализа (АСВ) с участием белка точечной DETEC-ции и количественное определение на паре изображений из того же геля и биологические вариации анализа (BVA) с участием согласования нескольких изображений из различных гелей, чтобы обеспечить статистический данные о дифференциальных уровнях экспрессии между несколькими группами.

(B) Белковые пятна, которые значительно отличаются, то могут быть выбраны и идентифицированы с помощью анализа MS.

(C) функции белка назначается для каждого из них с помощью функции белка Ассигнационного инструменты, таких как биоинформатика программа харвестера (www.harvester.embl.de) и те, в базе данных ресурсов человеческого белка (www.hprd.org) для того, чтобы смоделировать изменения пути метаболизма следующего паразита вторжение. В этом экзамене-PLE белка пероксиредоксин 1 было показано, что значительно подавлено в инфицированных клетках. Пероксиредоксин-функционально классифицируются как связанный с клеточным циклом / митозом и его модуляция согласуется с подавлением клеточного митоза после Toxoplasma инфекции.

(D) Круговая диаграмма показывает функциональное перераспределение 260 белков хозяина, что изменения после того, как Т. гондия

вторжение.

Эта цифра воспроизводится в цвете в разделе Цвет пластины.

молекулы подвергали скринингу на способность к Моду-конце нашествия Т. гондий в клетки. Исследование показало, что различные ингибиторы возмущают различные аспекты вторжения, в то числе скользящей моторики, секреции хост-клеточные адгезины из апикальных органелл, и расширения коноида. Неожиданно, экран также идентифицированы молекулы, которые значительно улучшенные нашествие, скользя моторику и секрецию microneme. Небольшие молекулы, идентифицированные с помощью этого подхода выявить ранее неизвестные сложности в контроле паразит моторики и microneme секреции, и они представляют собой набор полезных зондов для рассечения инвазивных механизмов T.gondii, и связанные с ними паразит (Carey и др., 2004),