Способы влияния на качество спермы и ее оценка

Часто приходится довольствоваться небольшим количеством спермы и радоватся, что есть хоть столько. Имея постоянного донора спермы, обычно хватает быстрого взгляда в микроскоп, чтобы оценить качество спермы перед ее использованием. Однако любой, кто берется за программу оплодотворения, должен ясно понимать влияние различных факторов, не только потому, что плохая сперма имеет мало шансов оплодотворить яйцеклетку, но и потому, что зараженная сперма может инфициpовать самку, что в свою очередь может привести к перитониту или стерильности. Известны случаи, когда некоторые пытались оплодотворить самку экскрементами, думая, что это сперма.

Сперма состоит из живых незащищенных клеток, находящихся в суспензии. Их нельзя подвергать температурному шоку, химическому воздействию, изменениям рН и осмолярности, иначе они быстро погибнут.

Поэтому, первый шаг в работе со спермой - это согреть все оборудование, которое будет с ней контактировать. Это проще всего сделать, помещая стеклянные пластинки, предметные и покровные стекла, а также разбавитель в инкубатор на пятнадцать минут перед использованием. Прямо перед забором спермы мы помещаем небольшие капли разбавителя спермы в каждую ячейку стеклянной пластины, используя пипетку на 250 микролитров со съемными наконечниками. Собранную сперму берут пипеткой и разводят в одной капле разбавителя. При достижении концентрации 1:1 мы переходим к другой ячейке. Если кажется, что какой-то образец спермы загрязнен или отличается по качеству от остальных, мы помещаем его в отдельную ячейку. В качестве разбавителя мы используем разбавитель для кур Beltsville; возможно, для соколов можно разработать более подходящий, но мы считаем, что и этот дает неплохие результаты. Таким образом, сперма поступает прямо в теплый разбавитель и изолирована от загрязнений.

На этой стадии нормальной практикой является исследование небольшого количества спермы при 400-кратном увеличении, быстрая ее оценка, загрузка того, что осталось и оплодотворение самки. Но чтобы иметь возможность быстро оценить качество спермы, необходимы более широкие знания относительно того, что нужно искать. Кроме того, иногда желательно более полно оценить конкретные образцы спермы, чтобы оценить продуктивность определенного самца и его возможный эффект на различных самок. Поэтому давайте шаг за шагом рассмотрим сперму более подробно.

Первый показатель - это количество. Может хватить и 10 микролитров, но обычно образец содержит 50 микролитров спермы, которые разбавляют до 100 микролитров. Это примерно одна капля. Нет необходимости использовать большее количество, потому что избыток склонен пузыриться, выливаясь из вывернутого яйцевода самки, а значит пропадет. Лучше использовать избыточное количество для другого оплодотворения.

Следующий показатель - это загрязнение. Нормальная сперма светломолочного цвета, часто с легким желтоватым оттенком. Иногда она почти прозрачная, иногда цвета соломы. Невооруженным глазом сложно отличить сперму от водянистых экскрементов, поэтому перед ее использованием необходимо рассмотреть сперму под микроскопом. Иногда образец загрязнен небольшими включениями из плотных белых солей мочевой кислоты. Если сперма ценна, можно попытаться отфильтровать сперму, отделив ее от плотных включений. Загрязнения опасны по нескольким причинам: соли мочевой кислоты имеют сильно кислую реакцию, они выглядят как острые похожие на сахар кристаллы. Живые подвижные сперматозоиды фактически плавают в смертельной кислотой ванне и через несколько минут погибнут. Естественно они не проживут в яйцеводе достаточно долго, чтобы сделать свою работу. Во-вторых ополаскивание яйцевода кислотой в лучшем случае вызовет раздражение, в худшем может вызвать, например, размягчение скорлупы яйца. В-третьих, рассматривание спермы, загрязненной экскрементами, обнаруживает мириады враждебных микроорганизмов, от хаотично движущихся бактерий до жгутиковых, приближающихся по размерам к сперматозоидам (рисунок 2.14.1 и 2.14.2). При введении в яйцевод они могут вызвать развитие инфекции яйцевода или, при проникновенни в полость тела, вызвать перитонит; они могут сохраняться в яйцеводе и инфицировать яйцеклетку при оплодотворении, вызвав раннюю смерть эмбриона. Загрязненная сперма может вызвать инфекции, передающиеся половым путем, что приведет к смерти яиц или самки, или сделает ее временно или постоянно стерильной. Следует придерживаться правила: не использовать то, в чем вы сомневаетесь.

В сперме могут присутствовать другие, менее смертоносные загрязнения. Часто сперма содержит дрожжевые грибы, которые выглядят как сферические тельца. Обычно они безопасны и не вызывают проблем. Эритроциты тоже не вызывают проблем, но они не должны появляться в сперме. Они указывают на наличие у самца повреждения тканей, что может быть вызвано неправильным забором спермы. В норме вы никогда не должны видеть в сперме красные кровяные шарики. Если они появились, самцу следует предоставить отдых в течение нескольких дней, чтобы повреждения зажили.

Получив удовлетворительное количество чистой спермы, следует произвести необходимые подсчеты. Разумеется, это зависит от того, насколько вы разбавили сперму. Грубо говоря, готовый к использованию образец должен содержaть около 100 сперматозоидов, видимых при 400-кратном увеличении (2.14.3). Сперматозоидов может быть в несколько раз больше, но если их меньше пятидесяти, тo вероятно, вы разбавили сперму слишком сильно. Если вам нужно точно подсчитать количество сперматозоидов в сперме конкретного самца, то сперма должна быть неразведенной и следует провести объемный анализ гемоцитометром.

Еще более важно, чем подсчет реального количества сперматозоидов, оценка их поступательного движения. В поле зрения при 400-кратном увеличении должны двигаться по меньшей мере десять сперматозоидов, и желательно, чтобы это было энергичное движение, при котором отдельные сперматозоиды быстро, примерно за 60 секунд, пересекали бы поле зрения. Это наилучший способ оценить способность спермы к оплодотворению. Хорошие образцы имеют сотни движущихся во всех направлениях сперматозоидов. Подвижность сперматозоидов сильно зависит от температуры. Образцы, хранящиеся в холодильнике, будут неактивны, но при нагревании до температуры тела, сперматозоиды должны проявлять максимальную активность. Недостаточный объем жидкости на предметном стекле может привести к тому, что сперма будет сдавлена покровным стеклом, что не позволит сперматозоидам двигаться; для оценки подвижности сперматозоидов очень важно, чтобы объем жидкости был достаточным.

Если у самца не забирали сперму в течение трех-четырех дней, находящаяся в семявыносящих протоках сперма состарится и может погибнуть. Поэтому лучше производить забор спермы каждый второй день, чтобы сперма была свежей. Если образец спермы выглядит относительно неактивным, иногда возможно различить живые сперматозоиды от мертвых, окрасив образец нигрозином. Мертвые сперматозоиды окрашиваются в розовый цвет, а живые остаются прозрачными. Для этого надо поместить пять небольших капель красителя на предметное стекло и нагреть до температуры тела. Добавить одну каплю спермы к красителю и хорошо перемешать с помошью тонкой иглы. Оставить на одну минуту для окрашивания. С помощью другого стекла размазать образец вдоль стекла, как при анализе крови. Быстро высушить над источником тепла и добавив каплю масла, внимательно рассмотреть под микроскопом. Сперма от разных видов окрашивается по-разному, и сегодня не существует полностью достоверного метода определения жизнеспособности сперматозоидов. Конечно, если выяснится, что большая часть сперматозоидов мертва, следует пересмотреть методику работы с самцом, а образец забраковать.

Еще одним важным показателем является форма сперматозоидов. В сперме всегда присутствует какое-то количество деформированных клеток. Это может быть следствием нарушения продуктивной фунции или проблем со здоровьем или потому, что самец является гибридом. Удивительно, но часто именно деформированные сперматозоиды наиболее подвижны.Некоторые из них имеют тела в форме буквы Y, некоторые длинные и тонкие, у некоторых два хвоста (см. фото). Если в сперме много подвижных нормальныx сперматозоидов, ее можно использовать, потому что способность к оплодотворению зависит только от апикального тельца и головки. Поэтому не волнуйтесь, дело не закончится появлением двухвостого сокола!

Во время всех этих процедур вы можете изменить осмолярность образца. Если драгоценная капля спермы слегка подсохнет, то концентрация раствора увеличится. Осмолярность жидкости вокруг мембраны сперматозоида будет вытягивать воду из клетки и иссушит ее. И наоборот, если разбавитель слишком разбавлен, то клетки начнут разбухать как лимоны. И то, и другое плохо.

Сперма может выглядеть одинаково, но работать по-разному. Лучшие результаты дает сперма, получаемая от частых добровольных копуляций у естественныx пар, или у добровольного донора-импринта. Такая сперма может оплодотворить яйцеклетку в течение 12 дней после осеменения. Для этого, вероятно, существует несколько причин. Во-первых, сперма свежая и зрелая, при этом не слишком долго хранилась в самце. Во-вторых, раствор спермы имеет оптимальные пропорции необходимых для жизни электролитов. В-третьих, она будет эякулирована чистой, без загрязнений. Такая сперма может храниться в холодильнике в течение 60-72 часов и сохранять способность к оплодотворению. Сперма, полученная путем ручного забора, гораздо более вариабельна. Она может быть несвежей, незрелой, может иметь неверные пропорции электролитов в семенной жидкости, в ней могут быть загрязнения. Все эти факторы влияют на возможность хранения спермы вне самки, и в яйцеводе, а также на способность спермы оплодотворять яйцеклетку. Поэтому, полученная пyтeм ручного забора сперма может быть такой же хорошей, как у добровольных доноров, и может быть откровенноопасной. Качество спермы сильно зависит от того, как заводчик работает с самцами, поэтому следует уделять пристальное внимание работе с птицами, иначе весь проект провалится.