Корнилов А.В. (6 курс, лечебный факультет)
Научный руководитель: к.м.н., доцент Окулич В.К.
УО «Витебский государственный медицинский университет»,
г. Витебск
Актуальность. В структуре хирургической заболеваемости в последние десятилетия отмечается неуклонное увеличение доли острых гнойно-воспалительных заболеваний. Это связано с влиянием многих факторов, в том числе и со снижением факторов неспецифической противомикробной резистентности и развитием интегральных гормонально-метаболических нарушений в организме на фоне хронических соматических болезней[1].
На сегодняшний день, параллельно с применением антибиотиков, возрастает число антибиотико-резистентных штаммов бактерий, частота и тяжесть инфекционных осложнений, попутно изменяющих свои клинические черты, что в свою очередь заставляет более детально изучать патогенез гнойно-воспалительных заболеванийиискать новые подходы к их лечению [1].
Одним из важнейших факторов иммунитета является нейтрофильная эластаза (НЭ) - основная сериновая протеаза человека, которая присутствует главным образом в азурофильных гранулах нейтрофилов. Этот фермент способен расщеплять широкий спектр субстратов эктрацеллюлярного матрикса, включая эластин, протеогликаны, коллаген и фибронектин. Действие эластазы контролируется ингибиторами сериновых протеиназ, в том числе элафинами SKALPи SLPI, которые присутствуют в экстрацеллюлярных жидкостях.[2].
Весьма важным представляется значение НЭ как регулятора воспаления, причем в разных ситуациях она может выступать и как провоспалительный, и как противовоспалительный агент. Известна протеолитическая активность НЭ в отношении многих растворимых протеинов - в том числе цитокинов воспаления. Описана способность НЭ in vitro блокировать 1-й и 3-й рецепторы комплемента, что снижает миграцию Т-лимфоцитов и нейтрофилов в очаг воспаления, подавляет их адгезивные свойства. НЭ расщепляет рецепторы липополисахаридов (ЛПС) CD14, что приводит к уменьшению экспрессии IL-8 и TNFα в ответ на стимуляцию ЛПС. Как известно, ЛПС являются главными компонентами бактериальной стенки. Таким образом, НЭ снижает воспалительный ответ на внедрение микроорганизмов [3].
Однако эластаза, секретируемая в очагах воспаления может вызывать и серьезные повреждения тканей. Считается, что эта протеиназа играет важную роль в развитии разнообразных воспалительных заболеваний, включая эмфизему легких, сепсис, артриты, нефриты [2].
Поэтому изучение патогенетических основ взаимодействия бактериального агента и макроорганизма является важной составляющей в поиске новых средств антибактериальной защиты.
Цель. Изучить эластазную активность сыворотки крови у пациентов с хирургическими заболеваниями гнойно-воспалительного генеза.
Материалы и методы исследования. Для определения эластазной активности пробы, содержащие сыворотку крови, перед использованием осаждали центрифугированием в течение 7 минут (10 тыс об/мин; центрифуга MICRO 120). Для постановки метода использовали эластин-Конго красный (диаметр частиц 37-75 микрон, производство Sigma) в концентрации 0,8 мг на 1 мл буфера, как субстрат для фермента, сыворотки ибуферный раствор (0,2 М солянокислый трис-буфер) с рН 7,4. Эластаза расщепляла эластин, и конго-красный переходил в раствор, изменяя его цвет с бесцветного накрасный с максимальным спектром поглощения 495 нм. Для удобства постановки вместо пробирок использовались эппендорфы. В эппендорфы вносили последовательно: 400 мкл раствора эластин-Конго красного на трис-HClбуфере рН 7.4 и 100 мкл сыворотки крови. Контролем служили пробы, содержащие буферный раствор в количестве 400 мкл и 100 мкл сыворотки крови. Далее проводили инкубацию проб в термостате при t=37º C в течение 20 часов. Затем пробы извлекали из термостата и центрифугировали в течение 7 минут (10 тыс об/мин; MICRO 120) для осаждения оставшегося эластина-Конго красного в виде не разрушенных частиц. Из надосадка брали в дублях по 150 мкл раствора и переносили в лунки 96 луночного полистиролового планшета. Планшет помещали в многоканальный спектрофотометр Ф300, где при длине волны 492 нм (максимально близкой к 495) определяли оптическую плотность в лунках. Результат рассчитывался как разница оптических плотностей опытных проб и соответствующих им контрольных.
Для пересчета полученных результатов в пикокаталы нами была использована формула, выведенная после построения калибровочного графика по разведенному Конго красному, в котором была отражена зависимость активности фермента от оптической плотности раствора, исходя из того, что при расщеплении 1 молекулы субстрата, в раствор переходит 1 молекула Конго красного.
Y= [-0,00117+0,0346×Eоп]×9,92
Где Y – искомый результат;
Еоп – оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля.
При помощи данной методики была исследована эластазная активность сыворотки крови у 9 доноров и 12 пациентов гнойно-воспалительными заболеваниями (трофические язвы, нагноившийся эпителиальный копчиковый ход, перитонит, сепсис). Забор сыворотки крови брали у пациентов, находившихся на лечении на базе Витебской областной клинической больницы и Витебской городской центральной клинической больницы.
Кровь забиралась натощак с 8 до 9 часов утра из локтевой вены, центрифугировалась со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 10 минут; сыворотка отбиралась, замораживалась и хранилась при –250 С.
Статистическая обработка полученных результатов и расчет среднего арифметического и стандартного отклонения производились при помощи программы Statgraph 2.1.
Результаты исследования. При оценке эластазной активности сывороток крови доноров, установлено, что её средний уровень при рН 7,4 равен 0,03±0,014 пкат.
Уровень эластазной активности сыворотки крови в группе пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями составил 0,049±0,02 пкат, и был достоверно выше, чем в группе доноров (р=0,006).
Выводы. У пациентов с хирургическими заболеваниями гнойно-воспалительного характера наблюдается достоверно более высокий уровень активности нейтрофильной эластазы в сыворотке крови (0,049±0,02 пкат), чем у доноров (0,03±0,014 пкат).
Литература:
1. Алиев, А. А. Системная энзимотерапия при неотложных состояниях в гнойной хирургии: диссертация... кандидата медицинских наук: 14.00.27, 159 c.
2. Алексеев В.В. Медицинские лабораторные технологии. Руководство в 2 томах / В.В. Алексеев, А.И. Карпищенко // Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2013. Т2. – 792 с.
3. Савельев, В.С., Буянов, В.М., Огнев, Ю.В. Острый панкреатит/ В.С. Савельев, В.М. Буянов, Ю.В. Огнев // Москва: Мир, 1983