Большинство выбираемых маркерных генов, обычно используемых для эукариотических клеток, не подходит для отбора стабильных трансформантов в Т. гондиях (Т. гондий является облигатным внутриклеточным паразитом). Только препараты избирательно влияющие на паразита, сохраняя при этом клетки-хозяева неповрежденным могут быть рассмотрены.
Несмотря на это ограничение, различные протоколы отбора были разработаны и представлены в таблице 15.1.
Хлорамфеникол показывает мощный, но задержанный паразитицидное эффект, что позволяет использовать E.coli, хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) не только в качестве фермента-репортера, но и в качестве плотного селективного маркерного гена (Kim и др., 1993). Паразиты должны завершить до трех циклов хоста-клеточного лизиса (до 7 дней), прежде чем эффект препарата очевиден. В этот момент паразита клонируют в 96-луночных планшетах в течение 5 дней, начиная в присутствии отбора лекарственных средств.
Другая стратегия выбора на основе резиста-ANCE к лекарственному средству может быть достигнуто за счет использования защитного эффекта BLE генного продукта Streptoalloteichus или Tn5 против ДНК-пробой Инг активности флеомицина (Мессина и соавт., 1995; Сольдати др., 1995). Паразиты, выражающие BLE становятся устойчивыми к препарату; однако, этот выбор должен быть применен на внеклеточных паразитов, чтобы быть эффек-TIVE. Выбор флеомицина был использован на успех полностью для случайной вставки трансгенов (Сольдати и др., 1995), а также для разрушения генов путем гомологичной рекомбинации (Мерсье и др., 1998). В качестве альтернативы лекарственной устойчивости, стабильная Selec-ции может быть достигнут путем комплементации в природе триптофана ауксотрофии токсоплазмов путем добавлением индола к культуральной среде (Сиб и др.,
Два гена, кодирующий несущественных реутилизация нуклеотидов ферментов эксплуатировались в качестве отрицательных селективных маркеров. Потеря урацил фос-phoribosyl трансфераза (УПРТ) активность придает устойчивость к пролекарству 5'-fluo-2'-deoxyuridine (ФУДР) (Дональд и Руса, 1995), и, в отсутствие гипоксантин-ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HXGPRT) активности, 6-thioxanthine (6-Tx) не может быть преобразован в качестве ингибитора GMP-синтазы (Donald и др., 1996). В HXGPRT-дефицитных мутантов этот ген также может быть использован для положительных стратегий выбора, так как микофенольная кислота эффективно убивает паразитов не хватает фермента.
| Механика ТРАНСГЕННЫХ паразитов ИЗГОТОВЛЕНИЯ | |||
| Таблица 15.1 стратегии выбора, маркеры генов и условия | |||
| Выбираемые маркерные гены | штамм реципиент | Процедура выбора или наркотики | интервал концентрации |
| КПП, E.coli | Дикого типа | хлорамфеникол; лекарственное средство | 20 μM CM |
| лечение в течение 7 дней | |||
| Перед клонированием | |||
| DHFR-TS, Т. гондий | Дикого типа | пириметамин; лечение | 1 μM PYR |
| в течение 2-х дней до клонирования | |||
| Бле, Streptoalloteichus, | Дикого типа | Флеомицин: два цикла | 5 μг / мл PHELO |
| или Tn5 | для лечения | ||
| 5-10 часов на внеклеточный | |||
| паразиты | |||
| HXGPRT, Т. гондий | RHhxgprt-, | Положительный выбор: | 25 μг / мл МПА, |
| ME49hxgprt-, | Микофенольная | 50 μг / мл XAN | |
| PRUhxgprt- | кислота + ксантин: | ||
| Лечение в течение 3 дней | |||
| Перед клонированием | |||
| Отрицательный отбор: | 80 μг / мл 6-TX | ||
| 6-Thioxanthine | |||
| УПРТ, Т. гондий | RH uprt- | Отрицательный отбор: | 5 μM ФУДР |
| 5'-fluo-2'-deoxyuridine | |||
| GFP / YFP, | Дикого типа | FACS | |
| Aequorea виктория | |||
| Основные гены, | Tati-1 | Anhydrotetracycline | Максимум. 1μM ATc |
| Т. гондий | условный KO | ||
| Cre рекомбиназы, | трансгенов | Переходная трансфекция | Нет выбора |
| Энтеробактерии | в окружении LoxP | с Cre выражения | |
| фага Р1 | сайты (рециркуляция | плазмида; клонирование | |
| маркеров) | незамедлительно после | ||
| электропорации | |||
| Т.К., вирус простого герпеса | Дикого типа | Ганцикловир, 24 часа | 10 μM GCV |
| лечение | |||
| CD-, E.coli | Дикого типа | 5-фторцитозин | 40 μM FLUC |
Частота стабильной трансформации fluctu-АТС значительно в зависимости от типа Selec-таблица используемого маркеров. Конформации плазмиды трансфекции (по сравнению с круговым линеаризуется ограничением) также могут влиять на эффективность трансфекции. Гораздо более высокая частота стабильной трансформации достижима с использованием векторов сопротивления пириметамина, полученные из бифункциональных дигидрофолатредуктазы-тимидилатсинтазов паразита, DHFR-TS. Искусственно мутировавший ген DHFR-ц от Т. гондий был использован для разработки выражения
вектор pDHFR * -TSc3 (№ 2854), который придает устойчивость пириметамина (Дональд и Рус, 1993). Выбор на основе DHFR-TS является уникальным, и показывает исключительную частоту chromoso-MAL интеграции до 5 процентов (Donald и Roos, 1993). Фланкирующие последовательности генов DHFR-TS ответственны за это необычное свойство, которое может быть частично возложенных на других генов-маркеров Selec-таблицы, такие как HXGPRT, если этот последний находится под контролем DHFR-TS фланкирующих последовательностей.
396 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма
Кроме того, фермент рестрикции-опосредованная интеграция (REMI) может быть использована для дальнейшего повышения частоты трансформации до 400-кратного (Black и др., 1995) и позволяет котрансфекции нескольких неотобранных конструкций вместе с одним селективным маркером. Любой из генов селективных маркеров, перечисленных выше, могут, при необходимости, быть энергосбе-ciently переработаны под действием сайт-специфической рекомбиназы Cre. Адаптация системы CRE LoxP от бактериофага Р1 до Т. гондия позволяет специфической в естественных условиях иссечения любой введенной последовательности, которая была в окружении LoxP последовательностей (Брехт и др., 1999).