Для изучения функции основных генов гаплоидного организма, инструменты должны быть разработаны, чтобы эктопический и избирательно контролировать экспрессию генов, избегая при этом плейотропных эффектах. Один широко используемый подход основан на системе кишечной палочки тетрациклина-репрессор, который контролирует экспрессию гена на уровне транскрипции. Исходная система тетрациклина-репрессор препятствует транскрипции, и была оптимизирована, и в сочетании с Т7-полимеразой, чтобы жестко регулировать экспрессию генов в Trypanosoma
| ИСПОЛЬЗОВАНИЕ трансгенных паразитов изучения функции паразитом ГЕНЫ |
РИСУНОК 15.3 Для легенды смотрите на следующей странице.
400 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма
РИСУНОК 15.3 Пометка субклеточных отсеков с флуоресцентными маркерами белка в Т. гондиях. На этом рисунке приведены примеры одно- и двойной флуоресцентный белок маркировки Т. гондий; все изображения были получены с помощью клеточной микроскопии живой.
(A) Плотные гранулы и паразитофорная вакуоль, Р30-GFP (Striepen и др., 1998); (B) centrocones (наружное большинство точек) и задняя IMC кольца матери (внутренний) дочерние клетки (линия), MORN1-YFP (Gubbels и др., 2006a); (С) ядрами, PCNA-GFP (Радка и др., 2001); (D), плазматическая мембрана, Р30-GFP-GPI (Striepen, неопубликованный); (E) micronemes, MIC3-GFP (Striepen и др., 2001); (F), цитоплазма, YFP-YFP (Gubbels и др., 2003); (G), внутренняя мембрана комплекс, IMC3-YFP (Gubbels и др., 2004); (H) микротрубочки, YFP-TUB (Ху и др., 2002); (I), митохондрии, HSP60-ОПП (ван Dooren, неопубликованное); (J), разделительные тахизоиты IMC3-YFP и H2b-MRFP (. Ху и др, 2004); (К) ядерного деления и цитокинез, H2b-MRFP и MORN1-YFP (Gubbels и др., 2006a); (L), apicoplast деление, FNR-ЗП и MORN1-YFP (Striepen и др., 2000); (М) Гольджи деление, ГРАСП-ЗП и MORN1-YFP; (N), apicoplast, АКТ-GFP (Валлер и др., 1998); (O) rhoptries, ROP1-GFP (Striepen и др., 1998); (Р) эндоплазматический ретикулум, Р30-GFP-HDEL.
Эта цифра воспроизводится в цвете в разделе Цвет пластины.
brucei (Вирц и др., 1999). Система Tet-репрессора также была разработана для других протозойных пара-сайтов, в том числе Т. гондий (Meissner и др., 2001). Генная слияние Tet-репрессора, как недавно сообщалось (ван Poppel и др., 2006), привело к более высокой экспрессии трансгена и более жесткое регулирование.
Несмотря на то, подходящий для экспрессии генов и токсичных доминантных негативных мутантов, эта система оказалась не подходим для генерации условных нокаутов в Т. гондиях. Действительно, необходимость держать паразит в присутствии лекарственного средства (anhydrotetracycline, АТЦ) в течение длительного периода, чтобы поддерживать экспрессию основного гена привел к генерации ревертантов, которые потеряли регулирование.
Для улучшения системы, генетический экран на основе случайной вставки был разработан, чтобы идентифицировать Func-ционной транскрипционную активацию домена в T.gondii, а также создать систему индуцируемого тетрациклина трансактиватора на основе (Мейснер и др., 2002). Этот экран привело к выделению двух искусственных transactivators, которые не были функциональными в клетках HeLa, иллюстрирующий различия между транскрипционной в паразита и его высшие эукариотические хозяева. Интересно, что эти transactivators соответствующих короткие отрезков, а гидрофобные аминокислот, также были активны в P. малярийного и позволили создать индуцируемые системы для малярийного паразита (Мейснера и Soldati, 2005). Эта система подходит для условного разрушения важных генов
без очевидного эффекта реверсии, и действует на паразитов в животной модели. В дополнение к TgMyoA, система Tet была реализована функционально анализировать TgAMA-1 (МИТАЛ и др., 2005) и определить важность нескольких других генов, в том числе TgMIC2 (Huynh и Каррутерсом, 2006), TgACP (Мазумдара и др., 2006) и профилин (Platnner и Soldati, неопубликованный).
До сих пор Tet-индуцируемая система была РЕЛА-тельно трудоемка, требует два этапа отбора. Первый шаг является построением стабильной линии, экспрессирующей индуцируемой копию интересующего гена. Вторым шагом является фактическим нокаутом гена-мишени (смотрите раздел протокола для более подробной информации). Кроме того, возможно, чтобы генерировать индуцируемые нокаутов путем прямого нацеливания индуцибельной конструкции в интересующего гена путем нок-ин, заменив эндогенного промотора с Tet-индуцируемого промотора. Это может быть достигнуто либо путем односторонний гомологичной рекомбинацией или, предпочтительно, с помощью двойной гомологичной рекомбинации, чтобы избежать возможной реверсии фенотипа иссечения плазмиды и восстановления дикого типа локуса. После того, как существенный ген был условно разрушали систему Т,
Подходы, которые специфически снижают уровень мРНК и, следовательно, уровень соответствующего белка являются мощными инструментами генетические
| ИСПОЛЬЗОВАНИЕ трансгенных паразитов изучения функции паразитом ГЕНЫ |
доступны во многих организмах. Различные технические Сол-ции, опирающиеся на антисмысловый РНК / олигонуклеотидах, рибозимах или дцРНК вмешательстве (иРНК), были разработаны. Такое нокдаун генов, как правило, легче и быстрее, чем выполнить в родах Тион условных нокаутов с использованием Tet-регулируемой системы. В Т. brucei, сочетание эффективной RNAi и жесткой Tet-регулируемой транскрипции обычно применяются в крупномасштабных функциональных геномных экранах (Улла и др., 2004).
В противоположность этому, эффективность RNAi в APICOM-plexans все еще является предметом дискуссий. Предыдущие исследования сообщили об успешном использовании антисмысловых / рибозимы в Т. гондиях (Nakaar и др., 1999, 2000). Более поздние исследования показывают, что иРНК может работать в T.gondii, (Al-Anouti и Ananvoranich, 2002;. Аль-Anouti и др, 2003). К сожалению, эти подходы в настоящее время не достаточно надежными для использования в широких экранах.