Т. гондий является неразборчивым в выборе клетки-хозяина, и заразить практически любую клетку млекопитающего, обычно используемую в тканевой культуре работе. В общем, крупные, размазанные клетки, такие как фибробласты или клетки Vero являются наиболее подходящими. Заражение этих клеток приводит к отличительным розеткам, что позволяет легко контролировать развитие паразитов с помощью микроскопии. Многие лаборатории используют трансформированные клеточные линии, такие как Vero или 3Т3, которые производят высокие урожаи паразита. Бессмертные линии растут быстро, легко культуру, и могут быть получены из многих источников.
также широко используются первичные клеточные линии, такие как фибробласты крайней плоти человека (HFF). Их сильный контакт торможение и медленный рост делают их клетки выбора для анализов бляшек, экспериментов брадизоитного-induc-ции, генетических выборов или любого Experi-ления, в котором культуры должны быть сохранены для
404 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма
более длительные периоды времени. Они также обеспечивают отличную микроскопию для клеточно-биологического анализа. Disad-Преимущество первичных линий в том, что они должны управляться более тщательно, так как они будут умирать более высокий номер канал из-за старение. Достаточное количество ранних пассажей клеток должно быть cryopre обслужено, чтобы возобновить культуру в этой точке. HTERT клетка (BD Biosciences) возникла в качестве компромисса; эти клетки бессмертны, но сохраняют многие характеристики первичных фибробластов. Авторы обнаружили, эти клетки эквивалентных клеток HFF практически во всех приложениях. Приведенные ниже протоколы основаны на клетки HFF, но могут быть использованы для HTERT клеток, а также (обратите внимание на разницу в концентрации gluta-шахтной). Многие реагенты снабженческих компаний для тканевой культуры; поставщики, упомянутые в следующем являются те, которые используются авторами,
• Сразу занимают обособленные клетки в определенном объеме Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM (Hyclone), если используются большие партии среда может быть получен из порошка, в противном случае использовать готовый носитель) с добавлением 10% сыворотки новорожденного теленка (NBCS, Hyclone, космические сыворотки теленка), пенициллин и стрептомицин (1: 200 10 000 единиц / мл наличия антибиотика, Hyclone) и глютамин (1: 100 из 200 мМ исходного раствора в воде; примечание: для HTERT клетка не добавляет глутамин, чтобы избежать зарастания культур) и разделить 1: 8 в новый
Колбы. Если грибковые загрязнения являются частой проблемой, используйте 1: 100 Fungizone (250μг / мл
амфотерицин В, Invitrogen). Переход к Инкубаторы-торов газированных до 5% CO2 на 37°C. Разрешить газообмен, ослабив колпачки. Слитые культуры могут храниться в течение нескольких недель до T. Gondii инфекции.
15.5.1.1 Поддержание клеток HFF
Культуры Т25 колбы ткани, как правило, дают 4-7 × 107паразиты (выходы, как правило, ниже, II и III киста образующих штаммов типа). Протоколы ниже, основаны на этой шкале. Если больше требуется материал, большие флаконы (например, T175), бутыли и клеточные фабрики были успешно использованы с соответствую-ветствующего масштабируемых протоколов.
• Теплые средства массовой информации и раствор трипсина в 37°С на водяной бане.
• Аспирируйте среда из вырожденной культуры и добавляют 2,5 мл раствора трипсина в колбу (0,25%
Трипсин и 0,2 г / л ЭДТА в HBSS (Hyclone); хранить это решение в меньших 5-мл аликвот при-20°C для удобства). Осторожно «мыть» монослоя наклоняя колбу несколько раз, а затем отсасывает большинство
раствор и оставить достаточно, чтобы только покрыть клетки (~ 0,5 мл). Выдержите на 37°С в течение 2 минут. Проверьте ячейки для округления и отряд с использованием инвертированного микроскопа, оборудованный фазовой или контрастной помехами оптики. Если клетки все еще прикреплены через 2 минуты, нажмите колбу с плоской стороной и / или продлить инкубации. HFF клетки относительно хрупкие, так что будьте осторожны, чтобы не перепроизводства Trypsinize.
15.5.1.2 Поддержание тахизоитами
• Аспирируйте среда из вырожденной HFF культуры.
• Добавьте 10 мл инфекции среды (DMEM, дополненной 1% фетальной сывороткой теленка (FCS, Invitrogen, для экспериментов, которые требуют жесткого контроля над небольшим составом молекулы, использование диализовало фетальную телячью сыворотку), пенициллин и стрептомицин (1: 200 из 10 000-единиц / мл антибиотика складе, Hyclone).
• Infect новой колбы с супернатанта культуры свежеприготовленным лизированных культуры. Как правило, проходящей 0,5-1,0 мл в T25 культуры приведет к полному лизису в течение 2-3 дней для относительной влажности полученных штаммов. Высокий инокулята является предпочтительным, если паразиты должны быть использованы, например, в эксперименте transfec-ции, так как большинство из тахи- zoites будет выход синхронно, что приводит к высокой общей жизнеспособности паразита. Поддерживать
штаммы, передают меньшее количество паразитов (например, 100 μл из лизированных культуры). Эффективность трансфекции и эффективность инвазии значительно возрастают при использовании свежего лизированных паразитов. Клетки не должны быть чрезмерно инфицированы. В идеале, каждая клетка-хозяин должен быть заражен одним паразитом.
| Toxoplasma Maniatis: подборка подробных протоколов для паразита культуры |
15.5.1.3 криоконсервации клеток-хозяев и паразитов
В общем, цель состоит в том, чтобы заморозить медленно и быстро оттаивают. Носите пальто лаборатории, защиты лица, и надлежащим образом изолирующие перчатки при обращении с жидким азотом. Для достижения наилучших результатов, имеет все пробирки и реактивы подготовлены и промаркированы, охладить их на льде, и работать быстро (если заморозить много ампул в то время, разделить их на более мелкие партии).
• Этикетка 2-мл криопробирки (снабжены силиконовым уплотнительным кольцом, Nalgene) с помощью пера раздаточное чернил, которая сопротивляется жидким азотом, и охладить на льду.
• Подготовка смеси изопропанол / вода, содержащей
замораживания контейнер (VWR, с помощью этого простого и недорогого устройства приведет к примерно 1°С / мин охлаждение в -80°С морозильной камерой; в качестве альтернативы, использовать тонкостенный контейнер пены, чтобы замедлить охлаждение).
• Используйте «» свежеприготовленные сливные (T175) HFF культур для замораживания. Trypsinize клетки, как описано выше, и восстановление отделенных клеток в DMEM 10% сыворотки новорожденного теленка в 15 мл стерильной
Центрифуга трубки. Гранулы клетка в настольной центрифуге при 900 г в течение 10 минут при 4°С помощью поворота ковша ротора.
• Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 1,8 мл охлажденной DMEM (без сыворотки). Добавить 1,8 мл среды замораживания (25% тканевой культуры класса ДМСО и 20% FBS в DMEM) и быстро перемешивают. Немедленно обойтись 0,5 мл аликвоты в охлажденный замораживания труб, плотно закрывают пробирки и
перейти в охлажденный (лед) контейнера морозильной камеры и поместить в -80°C морозильник.
• Оттепель один флакон на следующий день, чтобы гарантировать, что ваши запасы являются жизнеспособными, и переместить оставшиеся флаконы в емкость для хранения жидкого азота. Твердые бухучет, который отслеживает стойки, коробки, и пробирка положение имеет важное значение, так как это не так легко «поиск» для флаконов в жидких запасов азота.
• Паразиты сохраняются в качестве внеклеточного тахи-
zoites. Гранул свеже лизис культуры (1500 г, 20 минут, 4°С), а затем действовать, как описано для клеток-хозяев выше. План заморозить 2× 108на флакон, что означает, что вы будете производить три пробирки из одной T25 культуры, используя 0,8 мл DMEM и 0,8 мл среды замораживания. Тест для
Жизнеспособность оттаивания, прежде чем прекратить культуру данной линии.
• Паразиты также могут быть криоконсервации в клетках-хозяевах на стадии розеткой в среде DMEM с 50% FBS / 10% ДМСО.
• Для того, чтобы растопить клетки HFF, подготовить колбу со средним нагревали до 37°С. Удалите один флакон в то время, из жидкого азота, с помощью щипцов, и непос-
ately погружают в химический стакан, наполненный водой подогретой до 37°С, осторожно встряхивая флакон. После того, как среда оттаивают, передают клетки в колбу и инкубировать, как описано в стандартной культуре. Заменить среду после 12 часов.
• Для того, чтобы разморозить паразитов, используют описанную выше процедуру и инокуляции сливающийся T25 культуры.
15.5.1.4 Обнаружение микоплазм и удаление
Mycoplasma загрязнение часто чума тканевых культур. Тяжелая инфекция может повлиять на рост клеток-хозяев; микоплазмы ДНК может произвести нежелательный фон в генетических Experi-ке; и бактериальное загрязнение является серьезной проблемой для иммунологических экспериментов, поскольку микоплазмы полученных молекул stimu-мощно поздний различные иммунных клеток и функции. Простой тест на загрязнение может быть осуществлен с помощью окрашивания ДНК:
• Культуры клеток (и / или паразиты) для двух проходов в отсутствии антибиотиков (что приведет к массовому усилению бактерий), а затем перенести в шесть-луночные планшеты с покровные.
• Пятно покровных культур для бактериальной ДНК с использованием DAPI и стандартный протоколом IFA приведен ниже (более чувствительное окрашивание может быть получение кислоты / фиксацией спирта и Hoechst окрашивания, см Chen, 1977 для подробного протокола).
• В загрязненных культурах, можно наблюдать многочисленные мелкие точки окрашивания ДНК (размер примерно типичного apicoplast генома окрашивания) по всей цитоплазме клетки-хозяина.
• Более чувствительны ПЦР (АТСС, Stratagene), или на основе люциферазы (MycoAlert из Cambrex) анализов, также доступны.
406 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма
• При подозрении на недавнее заражение, отбрасывать культуры, размораживать свежий флакон с жидким азотом, и повторное тестирование. Протоколы к штаммам экрана, полученных из других лабораторий должно быть обычным делом.
• Если у вас есть «спасение» ваш конкретный штамм, лечение с Mycoplasma удаления агента в соответствии с рекомендациями производителя (ингибитор бактериальной гиразы, например MP Pharmaceuticals) в течение трех пассажей, а затем повторно проверить (этот антибиотик разумно переносятся Т. гондий на предложил концентрации). Другие коммерческие агенты убивают T.gondii, и должны быть проверены перед использованием в качестве агентов Mycoplasma elimina-ции.
• В качестве альтернативы, прохождение штамма через мышь и повторно выделение в культуре ткани будет удалить микоплазмы.
15.5.1.5 Пассирование Toxoplasma тахизоиты у мышей
• Тахизоиты любого штамма может поддерживаться при прохождении в брюшной полости мышей;
104 (Тип I штамма, т.е. RH) или 105 (Тип II, или III, штамм, т.е. ME49 или Prugniaud) инъецируют внутрибрюшинно в мышь.
• Тиражирование Т. гондий может быть собран из брюшной полости через 3 дня (для типа I штаммов) и через 5 дней (тип II, или III, штамм) путем перитонеального лаважа с 4 мл стерильного физиологического раствора или PBS.
• Этот материал может быть использован для последовательного прохождения деформации в перитонеальной полости мышей или для инфицирования клеток тканевой культуры. Мышиные воспалительные клетки (макрофаги и нейтрофилы) также будут рассматриваться в этом материале лаважа.
• Прохождение через мышей может быть полезно для удаления микроорганизмов, которые загрязненными Т. гондий культура ткани, при условии, что они не могут размножаться в мышиной брюшине. Эпизодические данные указывают на то, что периодическое мышиный прохождение штамма Т. гондий пассированного контин-uously в культуре ткани помогает поддерживать энергию и биологические характеристики штамма.
15.5.1.6 Пассирование Toxoplasma брадизоитный кист у мышей
• Стойкие киста образующие штаммы, такие как 76K, ME49 (PLK), и Prugniaud могут быть переданы с помощью инфекции мышей с кист, собранных из мозга зараженных животных, или инфекцией с тканевой культурой происхождения организмов (для этих штаммов, культурах тканей производят смесь тахизоитов и bradyzoites).
• Кисты или тканевой культуры, полученных организмы могут быть введены перорально или вводили subcuta-менно или внутрибрюшинно. Устные инфекции кист были Занимательно сообщается производить наибольшее количество кист головного мозга. В общем, 10-100 циста ткань, как правило, suffi-Cient для пероральной инфекции.
• Чтобы подготовить кисты ткани для инфекции, 3 мл стерильной 0,9% NaCl или PBS добавляют в один или два зараженных мышином мозг (ами), содержащей ткань кисты, и эта ткань разрушаются при прохождении через шприц с 18-го калибра иглой.
• Количество цист ткани определяется путем изучения 25-50 μл Аликвота этого материала под тканевой культурой микроскопа. Максимальные выходы сообщили кисты ткани из головного мозга происходят 4-8 недель после инфекции; Однако, кисты ткани будут сохраняться в течение жизни зараженных животных. Занимательно, повторили серийное прохождение ткани цистого образующий штамма каждые 4 недели у мышей приведет к увеличению числа цистого мозга, образуемому штаммом.
• Кисты могут быть очищены из мозга зараженных мышей путем центрифугирования с использованием метода Корнелиссена и соавт. (1981). мозг мышей гомогенизирует, используя отношение одного из мозга к 1,5 мл 0,9% NaCl в семи до десяти ударов в трубке Поттер (с использованием сыпучего ортопедическим пестика).
• Изопикнический градиент Перколла формируются
Центрифугирование 30 мл 45% (об / об) Перколле в PBS, рН 7,2, в течение 20 минут при 27 138 ×г; 5 мл суспензии мозга наслаивается на этом
Предварительно сформированный градиент и материал центрифугируют в течение 15 мин при 1250 × г.
| Toxoplasma Maniatis: подборка подробных протоколов для паразита культуры |
• После центрифугирования, в нижней части 4 мл содержат-ные эритроциты отбрасывают, а последующие 20 мл собирают. Этот 20-мл фракции (удельный вес 1,056) содержит цисты ткани. это
материал разбавляют 20 мл PBS и центрифугировали в течение 10 минут при 1000 ×г, чтобы сконцентрировать цисты в виде осадка, свободного от Percoll. Восстановление кист оценивается в 80 процентов с этой техникой.
• Кроме того, можно непосредственно смешивать 5 мл суспензии мозга с 30 мл 45% (об / об) в Перколл
PBS, рН 7,2, с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 27 138 ×г. Цисты встречаются в этом методе в том же 20-мл фракции, как при использовании предварительно градиента. Восстановление кист с этим альтернативным методом было оценено на 40 процентов.