Tagging субклеточных отсеков

Визуальное различных субклеточных отсеков является важным инструментом для анализа биологических клеток.

КОШКА

КОШКА

YFP

А / В дайджеста

1.5-2 кб

КОШКА цель.. YFP

одного гомологичной рекомбинации

Рисунок 15.2 Эксплуатируя негомологичную вставки и гомологичной рекомбинации манипулировать Т. гондий геном.

(A) Схематическое представление инсерционного геномной мечения с использованием плазмиды DHFR-TS (на основе Roos и др., 1997). Плазмидная ДНК указана в верхней части, геномные инсерции ниже. Для инсерционного мутагенеза, экспрессии гена устойчивости к пириметамин DHFR-TS приводится в движение своего собственного промотора; Таким образом, вставка не обязательно в открытой рамке считывания, но может также действовать через инактивировать регуляторную область (например, промотор). В случае промотора захвата, DHFR-TS не несет свой собственный промотор, и экспрессия гена устойчивости в зависимости от вставки вблизи активный промотор, или в рамке слитой в выраженном ген. Тандем вставки могут усложнить идентификацию меченых локуса с помощью плазмиды спасения (с использованием фермента рестрикции X) и / или обратной ПЦР (с использованием ферментом рестрикции X или Y). Тем не мение,

(B) Схематическое изображение гена выбивание через двойной гомологичной рекомбинации. Гомологичные участки, предназначенные для гомологичной рекомбинации представлены белыми коробками. Ферменты рестрикции А и В, используется для формирования полностью гомологичных концов. В этом случае YFP ​​используются в качестве отрицательного Selec стола маркера для обогащения гомологичной рекомбинации (YFP теряется и паразиты FACS-отрицательные).

(C) Схематическое представление замены аллельного через одного гомологичной рекомбинации. В этой стратегии через кольцевую плазмиду вставку и метку локуса с слияния YFP (который может быть опущен или заменен на укороченной ORF, чтобы создать функциональный нокаут). Ген-локус 3' плазмиды бэк-

кости функционально инактивируют отсутствие промотора.

Эта цифра взята из Gubbels, MJ, Мазумдара, J., ван Dooren, Г. и Striepen, B. (2006b). Биология токсоплазма: Манипулирование Toxoplasma Геном. Норвич: Horizon Press.

398 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма

Специфические антитела, полученные против субклеточных фракций или отдельных белков широко используются для этой цели в свето- и электронно-микроскопическом уровне. Этот подход, однако, требует Produc Тион антигена, либо путем очистки от пара-сайта или с помощью рекомбинантной экспрессии и последующей иммунизации, что отнимает много времени и не всегда технически осуществимо. Посредством трансфекции экспериментов, белки могут быть помечены путем слияния генов, используя общий эпитоп (для которых антитела уже доступны) или с использованием белка autofluorescent. Autofluorescent белки могут быть обнаружены в естественных условиях с минимальными манипуляциями, обеспечивая уникальный инструмент, чтобы следовать биологические процессы с течением времени (см Рисунок 15.3, и Gubbels и Striepen, 2004, для углубленного обзора).

Многочисленные варианты зеленого флуоресцентного белка (GFP) и родственные белки autofluorescent были успешно экспрессированы в Т. гондиях (Striepen и др., 1998; Ким и др., 2001), а теперь диапазон цветов доступен для одновременного использования мульти-PLE маркеры. Циан (КФП) и желтый флуоресцентный белок (YFP) является подходящей парой для двойной метки-ки экспериментов, и был использован в микроскопических исследованиях в естественных условиях из Toxoplasma органелл биогенеза (Striepen и др., 2000; Столяра и Roos, 2002; Pelletier и др., 2002). Тандем повторение выходов гена YFP исключительно яркие флуоресцентные трансгенов, которые в настоящее время широко используются для отслеживания паразитов в культуре ткани и у инфицированных животных (Gubbels и соавт, 2003, 2004, 2005;.. Иган и соавт, 2005). Красные флуоресцентные белки (RFP) дополнительно расширяют возможности. DsRed производит яркие флуоресцентные паразитов (Striepen и др., 2001); однако, потребность в тетрамеризации этого маркера может быть проблематичным, если меченый белок является частью комплекса или структуры. Мономерные варианты запроса предложений (например, MRFP;. Campbell и др, 2002), могут помочь более прибывавшие этим проблемы, но страдают от считаю, квалифицированно слабой флуоресценции. Новая «вишня» и «томатные» варианты (Шэнер и др., 2004) обеспечивают разумный компромисс, и тандем томатного маркер производит исключительно яркую флуоресценцию при экспрессии в Т. гондиях (Giel vanDooren и BS, не опубликован). но страдают от считают, квалифицированно слабой флуоресценции. Новая «вишня» и «томатные» варианты (Шэнер и др., 2004) обеспечивают разумный компромисс, и тандем томатного маркер производит исключительно яркую флуоресценцию при экспрессии в Т. гондиях (Giel vanDooren и BS, не опубликован). но страдают от считают, квалифицированно слабой флуоресценции. Новая «вишня» и «томатные» варианты (Шэнер и др., 2004) обеспечивают разумный компромисс, и тандем томатного маркер производит исключительно яркую флуоресценцию при экспрессии в Т. гондиях (Giel vanDooren и BS, не опубликован).

Большое количество органелл специфических маркеров флуоресцентного белка теперь доступно (рис 15,3

Например). Однако, не все белки могут быть изучены таким образом, как громоздкие GFP тег может повлиять на таргетинг, созревание, или функции его партнера по слиянию. В таком случае, эпитоп теги могут обеспечить альтернативный подход. Эти метки могут быть вставлены внутрь или помещают на N- и С-конце. Благодаря своей короткой длины, эпитоп теги вызывают ограниченные пространственные затруднения. Эпитоп теги требуют фиксации и окрашивания с специфическим антителом до visualiza-ния. Хотя не подходит для живых клеток, они могут быть использованы для субклеточных и ультраструктурных локализации и иммунопреципитационных экспери-ментов, или контролировать обработку белка во время ориентации или созревания. Ряд эпитопов тегов были успешно использованы в токсоплазмы - (. Sullivan и др, 2005), например, CMYC (. Delbac и др, 2001), HA (. Карстен и др, 1997), FLAG,

Паразиты, экспрессирующие флуоресцентные белки также могут быть проанализированы и отсортированы с помощью проточной цитометрии. сортировки клеток аменабельны для положительных и отрицательных селективных маркеров. Для получения клональных линий паразита, стабильно экспрессирующих флуоресцентный белок, два раунда флуоресцентно-активированных клеток сортировки (FACS) и расширение отсортированных паразитов в культуре (Gubbels и др., 2003), которые обычно используются. Несколько fluores-центовые белки могут быть использованы и сортируют simultane-ously; Однако, инструмент с несколькими лазерами может потребоваться (см раздел протокола). Флуоресцентные экспрессии белки также могут быть обнаружены с помощью планшет-ридер. Это обеспечивает удобный анализ роста для скрининга лекарственных средств и генетических выборов (Gubbels и др., 2003).