Генетический анализ путей, необходимых для роста в культуре требует условных мутантов.
402 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма
Температурная чувствительность (TS) из-за химически индуцированными точечные мутации может быть использована, чтобы получить штаммы, которые являются жизнеспособными при допустимой температуре и отображать мутантный фенотип при рестриктивной температуре. Для токсоплазмов, термочувствительный (Пфефферкорн и Пфефферкорн, 1976, Радка и др., 2000; Gubbels и Striepen, unpub-ликован) и холодный чувствительный (. Uyetake и др, 2001) мутантов были изолированы. Гумилева (N-этил-N-нитрозомочевина) индуцирует случайную точку MUTA-ции, и была мутагеном выбора в большинстве исследований Т. гондия. Химический мутагенез был успешно использован в T.gondii, для получения мутантов с дефектами в стадии differenti-Ц И А Ц, инвазия и выход (Синг и др., 2002) (черный и др., 2000;. Uyetake и др, 2001), и клетка деление и прогрессии клеточного цикла (Радка и др., 2000; Уайт и др., 2005).
При генерации химических мутантов прямо вперед, определяя мутантный ген, ответственный за фенотип не является. Два путями, наиболее часто используемые для достижения этой цели являются картированием-калибровочных физиологии НАН Украины через кресты и фенотипические комплементации путем трансфекции с библиотекой ДНК дикого типа. В то время как кресты осуществимы в Т. гондиях, их ограниченные пропускная способность делает их менее практичными в качестве общего инструмента для мутантного анализа (также, штамм RH используется в качестве рабочей области молекулярной биологии лошади для T.gondii, не может завершить половой жизненный цикл). Второй подход к идентификации гена затронут в данном мутанте является фенотипической-ментальностью Комплексы с использованием библиотеки дикого типа ДНК. Эта стратегия сталкивается с двумя техническими проблемами: полный предста-sentation генома (или транскриптом) в библиотеке комплементационной, и эффективное восстановление последовательности дополняя. Черный и его коллеги определили генетический элемент, который поддерживает стабильные эписомы в Т. гондий (черный и Бутройда, 1998), что позволяет удобно спасательные Hirt лизиса и трансформации бактерий. Библиотека гавань ИНГИ последовательности обслуживания эписомальной на позвоночнике успешно дополнила HXGPRT локус в нокауте-мутанте по выбору микофенольной кислоты. Анализ выделенных плазмид, однако, предположил, что они могли бы пройти обширную рекомбинацию, Библиотека гавань ИНГИ последовательности обслуживания эписомальной на позвоночнике успешно дополнила HXGPRT локус в нокауте-мутанте по выбору микофенольной кислоты. Анализ выделенных плазмид, однако, предположил, что они могли бы пройти обширную рекомбинацию, Библиотека гавань ИНГИ последовательности обслуживания эписомальной на позвоночнике успешно дополнила HXGPRT локус в нокауте-мутанте по выбору микофенольной кислоты. Анализ выделенных плазмид, однако, предположил, что они могли бы пройти обширную рекомбинацию,
|
|
потенциально снижая их стабильность и полезность (черный и Бутройда, 1998).
Вторые усилия для создания системы complementa-Тион было построено на высокочастотной Интегру Тион библиотечных плазмид (Striepen и др., 2002). Мутанты трансфицируют плазмидной библиотеки и подвергали селекции. Затем ДНК-последовательность-ального Комплексы (выполненная в виде стабильных CHRO-mosomal вставок) спасена в плазмиду с использованием ин витро рекомбинация (протокол системы Invitrogen шлюза; Хартли и др., 2000). Rescued вставка библиотеки может быть курсировала обратно в экспрессии паразита плазмиды через вторую стадию recombina-ции для подтверждения их комплементация Капака-ности. Библиотека кДНКа построен на этой модели успешно дополняется локус токсоплазмов HXGPRT при высокой эффективности (Striepen и др., 2002), и была использована для идентификации фенотипического подавителя из T.gondii, ерей клеточного цикла мутанта C9-11 (Radke и др., 2000; Уайт и др, 2005)..
|
|
Несколько TS мутанты не могли быть-mented Комплексы с использованием библиотек кДНК, описанных выше (Gubbels, белый и Striepen, unpub-ликовано). Гены, кодирующие большой мРНК и / или переписан на низких уровнях, как правило, недостаточно представлены в библиотеках кДНКа. Для преодоления этих проблем, большая вставки (40-50 кб) геномные сборок библиотеки космида на через DHFR-TS, содержащий супер-сов вектор был построен. Эта библиотека обеспечивает достаточный охват и эффективность преобразования, чтобы дополнить отсутствие HXGPRT в каждой трансфекции REAC Тион попытки. Кроме того, эти исследователи недавно дополнен мутант с дефектом деления клеток ц. Три перекрывающихся космиды были идентифицированы из независимых трансфекций, которые все питали ген для киназы как известно, участвуют в регуляции клеточного цикла (Gubbels и Striepen, неопубликованный;
| Toxoplasma Maniatis: подборка подробных протоколов для паразита культуры |
|
|
ПЕРСПЕКТИВЫ
Т. гондий зарекомендовал себя как отличный экспери-ментальная модель, и обратный генетические подходы были ключом к построению подробной молекулярной картины apicomplexan биологии. Обратный генетический инструмент ящик видел постоянное расширение и уточнение; Однако, по-прежнему несколько технологических проблем. Одна из этих проблем является в настоящее время завершена последовательность генома. Генома, очевидно, огромный ресурс, но количество генов «канди-дата» производства вычислительных экранов легко сокрушает пропускную способность многих функциональных генетических анализов, доступных в настоящее время. Нокдаунов и нокаутов условными являются мощные генетические эксперименты, но в настоящее время очень много времени и не увенчались успехом во всех случаях.
Протоколы, которые увеличивают частоту гомологичных над не-гомологичной рекомбинации может быть очень полезным, чтобы упростить процесс. Лучше понимание механизма рекомбинации ДНК APICOM-plexan и ферменты, участвующие в процессе, необходимо (Dendouga и др., 2002). На основе таких знаний и, следуя примеру ряда грибковых систем, рекомбинация путь может быть перестроен в disrup Тион не-гомологичной рекомбинации путей (Наяка и др., 2006) или, наоборот, overexpres-цессию элементов гомологического recombina-ного пути (Shaked и др., 2005) может улучшить частоту выбивки. РНК-опосредованный нокдаун представляет собой привлекательную альтернативу генного таргетирования. В то время как многообещающие, иРНК в T.gondii, в настоящее время не является достаточно надежным для крупномасштабных экранов (Al-Anouti и Ananvoranich, 2002;. Аль-Anouti и др 2003; Шэн и др., 2004). Улучшения могут быть получены из оптимизированных протоколов, чтобы выбрать и доставить интерферирующих РНК. Это также может быть возможным экран генетически для штаммов, которые показывают более высокую восприимчивость к дцРНКу.
Форвардные генетические подходы видели consid-жалкого прогресс, а также. Эти подходы могли бы дать ключ к механистическому анализу явлений, для которых геном не сразу Pres-Ent очевидного списка генов-кандидатов и белков.
В то время как инструменты, чтобы дополнить мутанты улучшились, и теперь может быть на уровне, чтобы обеспечить надежный анализ, способы создания и выбрать такие мутанты все еще отстают. Прочные экраны, которые снижают сложную клеточно-биологическое явление к фенотипу, который может быть легко забил гол в необходимы тысячи мутантов с ограниченным усилием. Успех визуальных экранов с использованием автоматизированных микро-скопическим обнаружения (Carey и др., 2004) указывает на одну авеню, чтобы достичь этой цели. В последнее десятилетие наблюдается огромный прогресс, движимый способность трансфецировать и генетически манипулировать паразитов. В следующем десятилетии потребуется набор инструментов, с достаточной пропускной способностью, чтобы в полной мере использовать последовательности генома.
Toxoplasma
Maniatis: подборка
ПОДРОБНЫЕ протоколы для