15.5.3.1 Налет анализа
Зубной налет анализы являются надежным способом измерения количества жизнеспособных и инфекционных паразитов в
| Toxoplasma Maniatis: подборка подробных протоколов для паразита культуры |
образец, и хорошо подходят для измерения стабильной эффективности трансфекции. Следующий протокол будет измерять стабильную трансформацию с использованием плазмиды сопротивления DHFR-TS.
• Электропорации тахизоиты, как описано выше, с использованием 50 μг pDHFR * -TScABP (Sullivan и др., 1999). После электропорации, разбавленных 50μл содержания кюветы в 950 μл cytomix или средний.
• Заражайте T25 HFF культуру в свободных от наркотиков среды с 3 μл и 6 μл разводили паразитом суспензию, и две культуры с 6 μл и 60 μл быть культивировали в присутствии 1 μM пириметамин.
• Выдержите в течение 7 дней, не нарушая колбы (оптимальное время может зависеть от используемого штамма; 2-3-мм дисков лучше всего подходят для СКОР-ков, несколько дополнительных Колб могут быть добавлены в большом эксперименте, чтобы быть «разработано» индивидуально тест, когда размер правой бляшки достигается). Период отбора занимает больше времени со штаммами III типа II и.
• Для того, чтобы окрасить монослой, аспирация среды, промыть PBS, фиксируют в течение 5 минут с этанолом и окрашивание в течение 5 минут с помощью кристаллического фиолетового раствора (растворить 12,5 г кристаллического фиолетового в 125 мл этанола и смешивают с 500 мл 1% оксалата аммония в воде).
• Удалить кристаллический фиолетовый раствор и промывают PBS.
• Воздух сухой, и подсчитать количество бляшек.
Этот анализ также может быть использован для количественного определения роста паразита путем измерения площади бляшки. Чтобы сделать это, сканирование окрашенных колбах со стандартным сканером с плоским слоем при 600 точек на дюйм, и использовать анализ изображения для измерений. Площадь бляшек может быть разумно Approxi-повязана с использованием эллипса. Измерьте длинные и самые короткие диаметры каждой бляшки, а также использованиеπAB / 4 для вычисления площади.
15.5.3.2 флуоресцентный анализ
Этот анализ будет производить динамические кривые роста в течение времени эксперимента (обычно в неделю).
• Семенной тканевые культуры, обработанные черный 384- или 96-луночные планшеты с особыми оптическими днищами (Beckton Dickinson) с клетками HFF. Для более масштабных анализов, автоматический дозатор жидкости (например, Genetix Q-Заливка) увеличит пропускную способность и воспроизводимость.
• После того, как пластины вырожденные, замените среды с DMEM (без фенола красного, Hyclone), 1% FCS, и антибиотиков, как описано выше.
• Infect каждой лунки с 2000 годом (384-луночный) или 5000 (96-луночный) тахизоитами (например, штаммом YFP-YFP; Gubbels и др., 2003). План иметь четырехместные скважины для каждого экспериментального условия (например, концентрации лекарственного средства) и не включают отрицательные (без паразитов) и положительного контроля на каждой пластине. Заполните все лунки с средой, но не используют самые удаленные скважины, поскольку они испаряются быстрее, что влияет на рост паразита.
• Измерение флуоресценции ежедневно для каждой лунки, в течение 5-8 дней, с помощью чувствительного планшет-ридер (BMG Fluostar или Molecular Devices SpectraMax M2, нижний возбуждение и излучение 510/12 и 540/12 нм, соответственно).
• Участок результатов (среднее из четырех скважин и отклонение Стана-Дард) в качестве положительного процента по отношению к необработанному положительному контролю в каждой пластине.
15.5.3.3 β Галактозидазы (LacZ) Анализ
Это представляет собой анализ роста конечных точек, которые могут быть использованы в форматах мульти-луночных (Макфэддно и др., 1997); желтый субстрат будет превращен в красный продукт.
• Семенной HFF клеток в стандартной тканевой культуре, обработанных 384-луночные планшеты, как описано выше.
• Изменение среды из сливающихся культур
DMEM, 1% FCS без фенола красного (50 мл / лунку), и заражают с 2000 βгалактозидазы экспрессирующих тахизоиты (мыть паразитов в PBS до заражения, чтобы исключить фенол красный).
• В нужный день считывания (обычно 5 дней после заражения - оптимальное окрашивание должно быть установлено
эмпирически для каждого штамма и состояния), добавьте 4,5 μл хлорфенол красно-β-galactopyranoside (CPRG, Boehringer Mannheim, 4,5 мМ запас в среде без фенола красного).
410 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МАНИПУЛИРОВАНИЕ токсоплазма
• Развитие цвета к желаемой интенсивности (если оставлено слишком долго, все скважины станут красными, использовать свою Nega-тивный и положительный контроль в качестве руководства), и читать оптическую плотность при 570 нме. Земля конечных точек как процент позитивности, как описано выше.
Анализ введение 15.5.3.4 урацил
В отличие от клеток млекопитающих, Т. гондий может непосредственно спасти урацил через УПРТ. Это может быть использовано для измерения роста паразита в зависимости от[3ЧАС]-uracil включения в паразит TCA осаждаемых нуклеиновые кислот (Pfefferkorn и Джейй, 1984;. Roos и др, 1994). Преимущество данного метода является то, что он может быть использован во всех штаммах и не требует трансгена. В последнее время 96-луночный формат в реальном времени был разработан для этого анализа; это подробно описано в Nare и соавт. (2002).
• Infect 24-луночных культуры с паразитами и INCU-БАТЭ в условиях испытания (например, в присутствии лекарственного средства).
• Добавить 5 ìКи [5,6-3ЧАС]-uracil (30-60 Ки / ммоль) в каждую лунку и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°C.
• Холод культур и добавляют равный объем охлажденного на льду 0,6 Н трихлоруксусной кислоты к среде каждой лунки, затем инкубируют на льду в течение не менее 1 часа.
• Удалить ТСА и промыть пластины под проточной водой в течение ночи (не забудьте использовать раковину инт-NAT для радиоактивной работы).
• Сухие плиты, добавить 500 ìл 0,1 н NaOH в каждую лунку, инкубируют в течение 1 часа, и измерения radioac-тельности в половине образца путем подсчета жидкости Scintilla-ции. В зависимости от используемого сцинтиляционной, нейтрализация основания может помочь избежать фона.