Как описано выше, этот подход имеет три этапа:
1. Представляя внематочную Tet-регулируемую копию гена-мишени
2. Ориентация на нативную локус путем гомологичной рекомбинации
3. Нокдаун экспрессии внематочной копии с помощью лечения AtC.
Выбор селектируемых маркеров могут отличаться от эксперимента к эксперименту (ТЕТ-TRANSACTI-Ватор линии [мейсснеровское и др., 2002] устойчив к воздействию
микофенольная кислота); этот пример будет использовать КПП, YFP, и DHFR-TS.
• Построить плазмиду для эктопической экспрессии гена-мишени, например, путем замены последовательности, кодирующей АКТ в плазмиду ptet07sag4-ACPmyc / DHFR-TS (Мейснера и др., 2002;. Мазумдар и др, 2006). Если опустить стоп-кодон, это должно привести к N-концевой трансляционной слияния с с-Мус эпитоп тега.
• Трансфекция в трансактиваторе линию Tati
(Мейснера и др., 2002), выберите стабильные Transfor-манты в присутствии 1 ìМ пириметамин, а клон, лимитирующим разведением.
• Тест-клоны для экспрессии трансгена по ИФА и Вестерн-блоттинга с использованием анти-CMYC антитела (МАт 9E10, Roche).
• Выберите клоны, которые экспрессируют трансген на тот же уровень, нативный ген. В зависимости от размера гена-мишени, добавление тега может привести к заметному сдвигу подвижности на SDS-PAGE. В этом случае антитело против белка-мишени может быть использована для сравнения обоих белков бок о бок.
• Очень важно определить, жестко регулируемое клон, прежде чем приступить к эксперименту KO. Тщательная характеристика клонов окупится с чистым, интерпретируемым фенотипом. Тест для
регулирование путем культивирования паразитов в прес-ENCE или в отсутствие 1 ìг / мл ATc (0,2 мг / мл в этаноле наличии) с последующим ИФА и Вестерн-блоттинга. Следует отметить, что стабильные белки, возможно, придется быть разбавлена путем роста. Сделайте первый экран после 5 дней лечения, а затем титровать минимальное время обработки для полного подавления, используя ваш клон сжатого.
• Целевые нативный локус, как описано выше (с использованием CAT / YFP положительного / отрицательного отбора), установить аллельную замену, а также анализировать регулирование внематочной копии в подтвержденных клонах KO ИФ и Вестерн-блоттингом.
Инсерционный мутагенез и тег спасательный
• Электропорации тахизоиты, используя 50 ìг линеаризуется (например, ограничен с помощью NotI) плазмида
| Toxoplasma Maniatis: подборка подробных протоколов для паразита культуры |
pDHFR * -TScABP. Выберите для стабильных Transfor-манты в 1μM пириметамин и применить нужный экран фенотипической. Клон мутанты по лимитирующему разведению, расширить в Т25 культуры и изолировать геномную ДНК, как описано выше.
• Настройка параллельно 20-μл ограничение переваривает с помощью нескольких ферментов рестрикции, которые режут раз в плазмиде (например, EcoRI, HindIII, XhoI, XbaI для pDHFR * -TScABP; см. Салливана и др (1999)
для карт и подробного обсуждения выбора фермента). Используйте 2μг геномной ДНК для каждого переварить и инкубировать в течение ночи при 37°C.
• Очищают ДНК из дайджеста, используя вращение Qiagen
колонка, в соответствии с протоколом производителя, и элюции в 30 μл буфера элюции.
• Смешайте 5 μл элюата с 2 μл 10х буфера лигазы NEB, 13 μL H2О, и 1 μл ДНК-лигазы Т4, и инкубируют в течение ночи при 16°C.
• Добавить 1 μл гликоген, 2 μл 3 М NaAc, рН 5,2, и 50 μл этанола, и осадок ДНК в течение 30 минут при -20°C.
• Промыть гранулу с 1 μл 70% -ного этанола, airdry на короткое время, и ресуспендируют осадок в 10 μL H2О.
• электропорации 1 μл в 25 μл библиотека эффективного Электрокомпетентные бактерии (мы нашли DH12S привести к лучшему восстановлению).
• Перенос в стерильную микроцентрифужной пробирку, добавьте 200 μл LB среды, и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С при встряхивании.
• Пластинчатый всю трансформацию на чашках с агаром LB, содержащей подходящий антибиотик (в данном случае, к ампициллину).
Метки также могут быть спасены обратной ПЦР - см Салливана и др. (1999) для разработки праймера и подробного протокола.
Химического мутагенеза
• ЕНУ является весьма токсичным и канцерогенным. Используйте все меры предосторожности со всеми материалами, которые вступают в контакт с этим химическим веществом - ярлык трубками и колбами, чтобы предупредить член вашей лаборатории, и распоряжаться загрязненных решений соответствующим образом.
• Мутагенная потенция может варьироваться от партии к партии, и должна быть титрует в анализе бляшек. Подготовка исходного раствора (100 мг / мл в ДМСО)
и хранить несколько аликвот при -20°C. Выполните трехкратной повторности бляшек с использованием 0, 25, 50 и 75 μл мутагена. Результаты Оптимального мутагенеза в 70 процентов убийства паразита по сравнению с необработанными контрольными (протокол ниже, предполагает
50 μл в качестве оптимальной дозы).
• Заражайте две сливающиеся T25 HFF культуры с
1.2 мл свежеприготовленного лизированных культуры за 24 часа до эксперимента.
• Заменить среду с 10 мл DMEM 0,1% FBS среды.
• Выдержите на 37°С в течение 30 минут.
• Добавить 50 μл Гумилева в колбу и 50 μл стерильной культуре ткани класса ДМСО в колбу B.
• Рассматривать в течение 4 часов при 37°C.
• Промыть культуры три раза 10 мл холодной стерильной PBS, и выбросить в контейнер выделенного отходов.
• Добавьте 10 мл PBS, царапать клетки с клеточным скребком, освободить паразит двух проходов через
25-га иглы (смотри раздел безопасности), и фильтруют через 3-μм поликарбонатный фильтр.
• Переход к 50-мл пробирку, добавляют 40 мл PBS, и спина при 1500 × г при 4°С в течение 20 минут.
• Ресуспендирует в 5 мл PBS и подсчет паразитов. Переходим к клонированию путем ограничения разведения. Желательно, чтобы контролировать эффективность мутагенеза каждого эксперимента путем анализа бляшек.