Первоначальные исследования по генетике передачи в T.gondii, полагались на маркеры лекарственной устойчивости, введенных относительно трудоемкий процесс химического MUTA-генеза, отбора и клонирования путем ограничения dilu-ции. Как правило, эти маркеры требуют применения лекарственных средств, которые либо избирательно нацелены на паразита или влияют на процессы хоста, которые не являются необходимыми для паразита (т.е. метаболизм ДНК) (Пфефферкорн, 1990). В обоих случаях пути должны быть несущественными или излишними паразита. Количество Mark-ров, которые соответствуют этим критериям, является относительно небольшим, и это является одним из основных факторов, препятствующих разработке сцепления ана-Сис. Микроспутниковый (МС) зонды, которые различаются по числу простых нуклеотидных повторов, были успешно использованы для разработки карты с высоким разрешением для P. малярийного (Су и др., 1999). В то время как MS зонды были использованы для анализа генетического водолаза-штаммов В городе Т. гондий (Айзенберг и др., 2002а), они не были достаточно обильные, или легко доступны до наличия всей последовательности генома, чтобы позволить их развитие генетическое картирование. Попытки увеличить число генетических маркеров для T.gondii, вместо того, чтобы полагаться на идентификации полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), обнаруженных между штаммами.
Попытки разработать маркеры ПДРФ для T.gondii, были основаны на кучки клонированных генов, доступных
| РАЗВИТИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ ИНСТРУМЕНТОВ |
в то время: кДНК зонды используют для Саузерн-блот-гибридизации с геномной ДНК (gDNAs) из репрезентативных клонов трех линий:. RH (тип I), ME49 (тип II) и КТГ (тип III), (Сибли и др 1992). ПДРФ не были в изобилии, и меньше, что 10 процентов одиночных дайджестов фермента показали, полезные полиморфизмы (Сиб и др., 1992). Случайный изолированные клоны из небольшой библиотеки вставки имели несколько более высокий показатель успеха примерно на 15 процентов, но этот низкий уровень полиморфизма был еще одним из основных факторов, препятствующая разработки достаточного количества маркеров. В конце концов, космидные клоны, состоящие из геномных вставок ~ 30 кБ были использованы для выполнения Southern гибридизации блота против рестриктазы расщепляют gDNAs из штаммов типа (Сиб и др., 1992). Это привело к гораздо более высокому уровню полиморфизма (~ 45 процентов одиночных дайджестов фермента выявленных полиморфизмов), по-видимому, потому что большая область генома сканировали в одном блоте. Хотя эти космидных зонды оказались очень полезными для установления исходных карт ПДРФА сцепления, эта библиотека оказалась большим процент химерных клонов, такой, что были найдены некоторые ПДРФЫ, которые были отображенные генетически к определенной группе сцепления для гибридизации с нескольких полос на PFG гели. В конце концов эти зонды были преобразованы в маркеров на основе ПЦР, устранения этой проблемы. В некоторых случаях, оригинальные маркеры, выявленные космиды были заменены на близлежащие полиморфизмов, которые были более надежными. Хотя эти космидных зонды оказались очень полезными для установления исходных карт ПДРФА сцепления, эта библиотека оказалась большим процент химерных клонов, такой, что были найдены некоторые ПДРФЫ, которые были отображенные генетически к определенной группе сцепления для гибридизации с нескольких полос на PFG гели. В конце концов эти зонды были преобразованы в маркеров на основе ПЦР, устранения этой проблемы. В некоторых случаях, оригинальные маркеры, выявленные космиды были заменены на близлежащие полиморфизмов, которые были более надежными. Хотя эти космидных зонды оказались очень полезными для установления исходных карт ПДРФА сцепления, эта библиотека оказалась большим процент химерных клонов, такой, что были найдены некоторые ПДРФЫ, которые были отображенные генетически к определенной группе сцепления для гибридизации с нескольких полос на PFG гели. В конце концов эти зонды были преобразованы в маркеров на основе ПЦР, устранения этой проблемы. В некоторых случаях, оригинальные маркеры, выявленные космиды были заменены на близлежащие полиморфизмов, которые были более надежными.
Одним из первых наблюдений этих исследований картирования ПДРФА был обнаружение того, что все ПДРФ Mark-ERS был, по существу биаллельным - то есть, один штамм неизменно отличаться при заданном RFLP в то время как другие два штамм разделил вторую аллель (Boothroyd и соавт., 1993). Частота редкого аллеля была выше в I типа штамма RH, хотя RH также разделяет многие аллели с не-вирулентных клонов типа II и III. Эта находка изначально стало неожиданностью из-за того, что я линия типа была показана высокая клоновая и генетически отличными от типов II и II в нескольких локусов (Сибли и Boothroyd, 1992a). Последующее секвенирование различных генов из разных клонов подтвердило наблюдение, что существует только две аллели в каждом локусе (Бюлы и Бутройде, 1991;
Parmley и др., 1994; Майзель и др., 1996). Эти выводы завершились в предложении модели, что клоновые родословные (т.е. I, II, III) возникла из нескольких тесно связанных родительских штаммов, в дикой природе - редкий пример естественной рекомбинации, что привело к трем очень успешным родам (Григг и др., 2001a;. Су и др, 2003а).