А. Приготовление и окраска препарата
а. Приготовление препарата
При приготовлении препарата необходимо учитывать количество забранного материала. При достаточном количестве биопсийного материала можно невооружённым глазом наблюдать фрагменты ткани в виде белесоватых комочков. При сильном надавливании в мазке будет много участков с механическими повреждениями, поэтому важно производить нанесение материала, не прикладывая излишних усилий.
| Приготовление препарата |
1. Методика приготовления мазка сдвигом
Поместить материал на предметное стекло,
| Z |
| Если в материал попали фрагменты ткани, сдвинуть стёкла одно относительно другого, слегка надавливая |
накрыть это стекло сверху ещё одним и аккуратно сдвинуть стекла одно относительно другого вправо и влево. Если в аспират попали фрагменты ткани, сдвинуть стёкла одно относительно другого, слегка надавливая на верхнее покровное (или обычное предметное стекло). Из двух приготовленных мазков разумно один использовать под окраску по Мэй -Гимза, а второй - по Папаниколау.
|
2. Методика приготовления препарата разрав
ниванием
Если в пробу попала кровь, мазок приготавливается путём разнесения небольшого её количества по предметному стеклу с помощью покровного стекла.
| Если материал-жидкость |
3. Методика приготовления препарата раз
брызгиванием
Если материала мало, после переноса из
| ^ |
иглы на предметное стекло можно оставить его как есть, а затем подвергнуть окраске.
Б. Основные методы окраски
Окраска по Мэй-Грюнвальд Гимза
Этот метод окраски также называют окраской по Паппенгейму. Приготовленный мазок быстро высушивают потоком холодного
воздуха, например, с помощью фена для сушки волос, имеющего соответствующий режим, а затем окрашивают. Естественное высыхание мазков нежелательно, так как это приводит к разбуханию клеток. В случае окраски только красителем Гимза, после просушивания мазка производится его фиксирование метанолом.
Методика окраски
1. Фиксировать в растворе Мэй-Грюнвальд в течение 3 минут.
2. Добавить равное количество 0,02М буферного раствора фосфорной кислоты (рН 6.4) и оставить на одну минуту.
3. Промыть мазок разведённым раствором Гимза (примерно 20 секунд).
4. Окрашивать в разведённом растворе Гимза 15 минут.
5. Смыть проточной водой красящий раствор с оборотной стороны предметного стекла.
6. Просушить.
Приготовление 0,02М буферного раствора фосфорной кислоты: 100 миллилитров 0,2М буферного раствора фосфорной кислоты+ 900 миллилитров дистиллированной воды.
Приготовление разведённого раствора Гимза: 160 миллилитров 0,02М буферного раствора фосфорной кислоты (рН 6,4) +6 миллилитров раствора Гимза.
Окраска по Папаниколау
Приготовленный мазок быстро фиксируется в 95% этаноле. Если произошло высыхание мазка, его окрашивают по Мэй-Гимза. Время окрашивания подбирается в зависимости от состояния красящего раствора.
Методика окраски
1. Фиксировать в 95% этаноле не менее 15 минут.
2. Поместить в 80% этанол.
3. Поместить в 70% этанол.
4. Поместить в 50% этанол.
5. Промыть под проточной водой 5 минут.
Практические аспекты тонкоигольной аспирационной биопсии 299
6. Промыть дистиллированной водой.
7. Поместить в Гематоксилин Гилла V от 2 до 6 минут.
8. Промыть дистиллированной водой.
9. Поместить в 0,05%-0,25% соляную кислоту на 1 минуту (одна капля концентрированной соляной кислоты на 50 миллилитров дистиллированной воды дают нужную концентрацию 0,05% -0,25%).
10. Промыть под проточной водой 5 минут.
11. Промыть дистиллированной водой.
12. Поместить в 50% этанол.
13. Поместить в 70% этанол.
14. Поместить в 80% этанол.
15. Поместить в 95% этанол (два раза).
16. Поместить в OG-6 на 2 минуты.
17. Поместить в 95% этанол (два раза).
18. Поместить в ЕА-50 на 2 минуты.
19. Поместить в 95% этанол (два раза).
20. Поместить в чистый этанол (два раза).
21. Поместить в ксилен (три раза).
22. Защитить с помощью Permount.
Иммуногистохимия
Данная методика, используя специфические антитела, позволяет видеть в световом поле распределение в клетках веществ, обладающих свойствами антигена. Эту методику полезно применять при дифференциации опухолей, диагностика которых морфологически затруднительна. Например, для дифференциации медуллярного рака используются антитела к кальцитонину. Для дифференциации от метастатическсго рака используется окраска антителами к тиреоглобулину. Для окраски обычно используют фиксированные 95% этанолом и сохранённые влажными мазки. Однажды высушенные мазки часто дают неспецифическую реакцию, поэтому непригодны к иммунной окраске. Однако если использовать поверхностные маркеры лимфоцитов (CD4, CD8 и другие), мазок после высыхания фиксируют раствором, состоящим из равных долей метанола и ацетона, и формалиновым буфером. Защищенные покровным стеклом мазки, окрашенные по Папаниколау, после обесчвечивания в соляной кислоте с этанолом также можно подвергать иммунной окраске. Обычно применяют методики ABC и РАР.
Методика окраски
1. Промыть0,01М буферным раствором фосфорной кислоты.
2. Блокировать 1% нормальной сывороткой крови или 2% снятым молоком, 10 минут.
3. Первые антитела, 4°С на ночь, или при комнатной температуре 20 минут.
4. Промыть 0,01М буферным раствором фосфорной кислоты, 5 минут (три раза).
5. Блок пероксидазы 0,3% перекисью водорода, 10 минут.
6. Промыть 0,01М буферным расвором фосфорной кислоты, 5 минут (три раза).
7. Вторые антитела (маркирование биотина и пероксидазы), комнатная температура, 30 минут.
8. Промыть 0,01М буферным раствором фосфорной кислоты, 5 минут (три раза).
9. Меченые антитела, комнатная температура, 30 минут.
10. Промыть 0,01 М буферным раствором фосфорной кислоты, 5 минут (три раза).
11. Проявление цвета в DAB (3,3-диаминобензидин, тетрагидрохлорид), 5-Ю минут.
12. Промыть водой, 5 минут.
13. Окраска ядер гематоксилином Майя, 30 секунд.
14. Промыть водой, 5 минут.
15. Удаление воды, просвечивание, наложение покровного стекла.